微小隐孢子虫表面抗原CP23基因的克隆及表达

目的构建微小隐孢子虫表面抗原CP23基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法用微小隐孢子虫卵囊感染免疫抑制BALB/c小鼠,用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化微小隐孢子虫卵囊,用酚-氯仿抽提法提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,然后克隆至TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将CP23基因片段用限制性内切酶切下克隆至pET-30a(+)载体,构建pET-30a-23质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果扩增出约340bp的微小隐孢子虫CP23基因片段并成功构建pET-30a-23质粒,表达出分子质量单位为27ku的融合蛋白,Western blot显示该蛋白能被抗微小隐孢子虫血清识别。结论成功构建pET-30a-23质粒,表达产物具有免疫反应性,为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制打下了基础。

微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP23融合蛋白在大肠杆菌的表达

目的 构建微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP2 3的原核表达载体 ,并且在大肠杆菌中表达。方法 用HindⅢ和EcoRⅠ酶分别从 pET - 2 8a(+)和 pMD18-T - 2 3质粒中酶切得到线性片段和CP2 3基因片段 ,然后用T4酶连接 ,构建重组的CP2 3的原核表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,并用SDS -PAGE、ELISA和Westernblotting进行鉴定。结果 构建了CP2 3的原核表达载体 ,得到了一分子量约为 14kDa的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 36 %。结论 CP2

微小隐孢子虫重组BCG-Cp23疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。方法用微小隐孢子虫感染免疫抑制BALB/c小鼠,用蔗糖密度梯度离心法纯化其粪便中的卵囊,酚-氯仿法提取微小隐孢子虫的基因组DNA,PCR扩增Cp23基因片段,然后将其克隆TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将Cp23基因片段用限制性内切酶切下克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白(HSP)启动子下游,构建重组质粒pMV262-Cp-23,用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗(BCG-WT)构建微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。结果扩增出约360bp的微小隐孢子虫Cp23基因片段并成功构建pMV262-Cp23质粒,通过PCR扩增和提取质粒、酶切表明质粒正确导入BCG-WT中。结论成功构建微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗。

微小隐孢子虫CP23基因真核表达载体pcDNA3.0-23的构建及鉴定

目的构建微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23。方法提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将CP23基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA 3.0-23重组质粒。通过PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-23进行鉴定。结果扩增出约340 bp的微小隐孢子虫CP23基因片段,并成功构建微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23。结论微小隐孢子虫CP23真核表达载体pcDNA3.0-23的构建为微小隐孢子虫的基因疫苗研制奠定了基础。

微小隐孢子虫CP23 DNA疫苗免疫保护作用研究

目的研究微小隐孢子虫表面抗原CP23 DNA疫苗产生的免疫反应及对小鼠的免疫保护作用。方法选BALB/c小鼠60只,随机分为3组,即疫苗免疫组、PBS对照组及空质粒对照组。疫苗免疫组用构建的真核表达质粒pcDNA 3.0-23每隔2周免疫1次小鼠,共免疫3次。PBS对照组肌注等量PBS,空质粒对照组肌注pcDNA3.0,免疫方法及次数同疫苗免疫组。末次免疫2周后,分别取小鼠脾脏、血清,检测CD4+和CD8+T细胞、细胞因子IFN-γ及抗CP23特异性抗体IgG和IgA滴度;用微小隐孢子虫攻击感染被免疫小鼠,收集小鼠粪便,计算小鼠排出的卵囊量。结果 PBS对照组及空质粒组比较,疫苗免疫组小鼠的CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值及脾细胞培养上清中IFN-γ滴度均显著升高(P<0.05),小鼠血清抗CP23特异性抗体IgG及IgA滴度随免疫次数增加显著升高(P<0.05),攻击感染后小鼠排卵囊量显著减少(P<0.05),且排出时间缩短。结论构建的微小隐孢子虫表面抗原CP23真核表达质粒能够诱导小鼠产生细胞及体液免疫反应,对小鼠有较好的免疫保护作用。

保定地区奶牛微小隐孢子虫Cp23基因的原核表达及免疫原性分析

采用PCR技术扩增了微小隐孢子虫Cp23基因,将Cp23基因克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,构建重组表达载体pET28a-Cp23。将其转化至宿主菌E.coli BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE结果表明,蛋白相对分子质量为25 000,目的蛋白高效表达,且为包涵体蛋白。Western blot结果表明,表达产物可被微小隐孢子虫阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。本研究为抗微小隐孢子虫疫苗和免疫学诊断方法的研制提供候选抗原。

微小隐孢子虫pcDNA3.0-23重组质粒免疫效果评价

目的比较微小隐孢子虫表面抗原CP23真核表达载体pcDNA3.0-23经不同免疫途径产生的免疫效果。方法提取微小隐孢子虫基因组DNA,PCR扩增CP23基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcD-NA3.0-23重组质粒,分别通过肌肉注射和滴鼻(粘膜)免疫2种途径免疫BALB/c小鼠,免疫3次,2周后检测抗CP23特异性抗体IgG滴度、小鼠脾脏、血清中CD4+和CD8+T细胞、细胞因子γ干扰素(IFN-γ);用微小隐孢子虫攻击感染被免疫小鼠,收集小鼠粪便,计算小鼠排出的卵囊量。结果肌注组与滴鼻组小鼠血清抗CP23特异性抗体IgG滴度随免疫次数增加均明显升高,高于对照组及空质粒组(P<0.05),肌注组高于滴鼻组(P<0.05);肌注组与滴鼻组小鼠的CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值均高于磷酸缓冲液(PBS)对照组及pcDNA3.0空质粒组(P<0.05),但2种免疫途径的差异无统计学意义(P>0.05);肌注组和滴鼻组脾细胞培养上清中IFN-γ明显高于对照组及空质粒组(P<0.05);微小隐孢子虫攻击小鼠后,2种免疫途径的小鼠排出卵囊量明显少于对照组,且排出时间缩短,2种途径的差异无统计学意义。结论 pcDNA3.0-23重组质粒作为基因疫苗,可产生较好的细胞及体液免疫反应;不同的免疫途径可产生不同的免疫反应。