CpG ODN对鸡新城疫LaSota活疫苗的免疫增强效应

将3种不同的未甲基化CpG ODN分别与新城疫LaSota活疫苗混合后,经滴鼻和点眼免疫鸡,通过检测鸡血清中HI抗体、外周血T淋巴细胞增殖活性、诱导巨噬细胞分泌NO含量,以及刺激外周血淋巴细胞表达IFN-γ、IL-6与IL-1βmRNA量,分析各CpG ODN对新城疫LaSota活疫苗免疫效果的影响。结果表明,经2次免疫后,含GTCGTT核心基序的CpG ODN1组,鸡血清平均HI抗体效价最高达8.2log2、淋巴细胞刺激指数达9.836、NO分泌量达35.833μmol/L,分别比疫苗单独免疫组高出2个滴度(P<0.05)、4.4(P<0.01)、27.6μmol/L(P<0.01);含GACGTT核心基序的CpG ODN2组增强作用不明显,与疫苗单独免疫组无差异;而CpG ODN3的免疫刺激活性由于受其侧翼序列的影响,作用明显减弱甚至丧失。对细胞因子的影响,CpG ODN3组IFN-γmRNA表达量稍高于CpG ODN1组,而其余细胞因子均以CpG ODN1组表达水平最高(P<0.05)。由此证明CpG ODN1能显著增强鸡对新城疫LaSota活疫苗的体液和细胞免疫反应,可以作为高效的免疫增强剂。

CpG ODN对哮喘小鼠气道炎症及GATA-3的影响

目的观察CpGODN对支气管哮喘小鼠气道炎症及肺组织GATA-3mRNA表达的影响。方法将40只雌性BALB/C小鼠随机分为4组(每组10只):生理盐水对照组(A组);哮喘组(B组);CpGODN干预组(C组);GpCODN对照组(D组)。以鸡卵白蛋白(OVA)致敏小鼠建立哮喘模型,C组和D组在OVA激发前分别予CpGODN及对照GpCODN腹腔注射。在末次激发后24h收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液行白细胞计数及EOS分类计数,ELISA法检测各组小鼠BALF中IL-4、IL-5及IFN-γ水平,肺组织HE染色观察其病理变化以及用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺组织中GATA-3mRNA的表达。结果各组BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比、IL-4、IL-5和IFN-γ浓度分别为:A组为(7.46±1.77)×105个/mL、(0.75±0.48)%、(26.9±4.6)pg/mL、(41.7±5.1)pg/mL和(110.4±12.1)pg/mL,B组为(21.68±4.40)×105个/mL、(9.50±1.13)%、(267.6±24.5)pg/mL、(218.2±15.2)pg/mL和(47.9±9.6)pg/mL,C组为(8.98±2.23)×105个/mL、(2.90±0.86)%、(85.9±8.1)pg/mL、(63.0±9.6)pg/mL和(221.0±29.9)pg/mL,D组为(20.41±3.47)×105个/mL、(9.60±1.30)%、(260.7±15.7)pg/mL、(205.1±15.8)pg/mL和(52.2±10.7)pg/mL。B组与A组比较差异有显著性(P<0.01),C组与B组比较差异有显著性(P<0.01),D组与B组比较差异无显著性(P>0.05)。C组小鼠肺组织GATA-3mRNA的表达较B组明显减低,差异有显著性(P<0.01),D组与B组比较差异无显著性(P>0.05)。结论CpGODN可以抑制哮喘小鼠Th2型细胞因子生成,抑制肺部GATA-3mRNA的表达,减轻哮喘气道炎症。

微波消融联合CpG ODN治疗小鼠移植性结肠癌及对免疫状态的影响

目的研究微波消融联合CpGODN对小鼠移植性结肠癌的治疗作用及对免疫状态的影响。方法 Balb/c小鼠皮下接种结肠癌CT26细胞建立肿瘤模型,肿瘤分别给予瘤周注射PBS、微波消融、微波消融+瘤周注射CpGODN和瘤周注射CpGODN四种处理。定期测量肿瘤大小,利用流式细胞仪检测小鼠外周血中CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+细胞的比例;采用ELISA检测小鼠外周血中IL-2、IL-12和IFN-γ含量。给予微波消融组和微波消融联合CpGODN组治愈的小鼠再次接种CT26细胞,观察成瘤率。结果微波消融组和微波消融联合CpGODN组小鼠的肿瘤体积显著小于PBS组和CpGODN组。4组小鼠外周血中的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞比例无显著性差异,微波消融联合CpGODN组及微波消融组的CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞比值分别为1.58±0.10和1.53±0.13,与PBS组和CpGODN组相比显著升高(P均<0.05)。微波消融联合CpGODN组小鼠外周血中IL-2浓度为(64.6±7.4)pg/ml,IL-12浓度为(314.1±26.9)pg/ml,IFN-γ浓度为(61.9±7.3)pg/ml,显著高于其他3组(P均<0.05)。肿瘤再次攻击实验中微波消融联合CpGODN组成瘤率为25.0%,显著低于微波消融组的75.0%(P<0.05)。结论 CpGODN增强了微波消融治疗小鼠的免疫功能,减少了肿瘤再次攻击的成瘤率。

新型CpG ODN增强乙肝疫苗诱导IgG2a类抗体产生的实验研究

目的寻找能增强乙肝疫苗刺激IgG2a类抗体产生,使机体处于Th1样免疫环境的新型乙肝疫苗佐剂。方法选用自行设计的A、B、C型CpGODN,并以发表的A、B型CpGODN作为阳性对照,与重组乙肝疫苗混合后于第0、4周免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测免疫小鼠血清中HBsAb水平及种类。结果各型CpGODN都能增强乙肝疫苗刺激HBsAb的产生水平,CpGODN+乙肝疫苗免疫的小鼠血清中HBsAb类型为IgG2a>>IgG1,而单独应用商品化重组乙型肝炎疫苗的小鼠血清中HBsAb类型为IgG1>>IgG2a。结论各型CpGODN对重组乙型肝炎疫苗[含Al(OH)3佐剂]均具有增效作用,而且可以诱导机体产生倾向于Th1途径的免疫应答反应。

CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的抑制作用

目的明确抑制性CpG ODN 208(CpG-N ODN)对刺激性CpG ODN 1826(CpG-S ODN)诱导单核/巨噬细胞分泌TNF-α的影响,为通过拮抗细菌DNA达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法选用本室前期筛选出的对CpG-S ODN活化RAW 264.7细胞有抑制作用的CpG-N ODN,观察其对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的影响;应用流式细胞术观察CpG-NODN对CpG-S ODN与hPBMC表面结合和内化的影响。结果浓度比为1∶1的CpG-N ODN对刺激性CpG-S ODN诱导hPBMC分泌TNF-α具有抑制作用,并呈一定时效关系;CpG-N ODN对CpG-S ODN在hPBMC细胞表面的结合和内化具有抑制作用。结论CpG-N ODN对CpG-S ODN活化hPBMC具有抑制作用,这个作用可能与其影响hPBMC的表面结合和内化CpG-S ODN有关。

CpG ODN对Treg细胞及Th17细胞分化的影响

目的研究免疫佐剂CpG ODN对小鼠脾细胞中Treg细胞、Th17细胞分化的影响,为进一步的临床免疫治疗应用奠定基础。方法体外分离小鼠脾细胞后,加入抗CD3单抗及抗CD28单抗培养,并相应加入诱导Treg细胞分化的细胞因子TGF-β、IL-2或诱导Th17细胞分化的细胞因子TGF-β、IL-6、IL-23,培养24h后加入CpG1982、CpG1826继续培养48h,培养结束后收集细胞进行细胞内染色流式细胞术检测Treg/Th17细胞,利用实时定量PCR检测Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17mRNA的水平,Western blot检测Foxp3、RORγt蛋白表达,ELISA检测脾细胞培养上清IL-10、IL-17水平。结果在细胞因子TGF-β、IL-2的诱导下,CD4+Foxp3+Treg细胞数量明显增多,核转录因子Foxp3 mRNA和蛋白水平均增高,且细胞培养上清中IL-10的水平也升高,在细胞因子诱导的同时加入CpG1826培养后CD4+Foxp3+Treg细胞数量明显减少,Foxp3水平降低,培养上清中IL-10的水平降低,差异具有统计学意义(均P<0.05);单独加入CpG1826以及在培养液中加入细胞因子TGF-β、IL-6、IL-23后,Th17细胞数量均明显增加,核转录因子RORγt水平升高,细胞培养上清中IL-17水平增加,与对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05),CpG1826联合细胞因子组则对Th17细胞分化具有更加明显的刺激效应(P<0.05)。结论免疫佐剂CpG1826具有抑制小鼠脾细胞中Treg细胞分化、促进Th17细胞分化的作用,从而发挥对Treg/Th17系统的调节功能。

CpG ODN纳米粒增强免疫抑制小鼠对重组乙肝疫苗的免疫应答

目的:探讨CpG ODN壳聚糖纳米粒联合重组乙肝疫苗对免疫抑制小鼠的免疫增强作用。方法:选用环磷酰胺建立免疫抑制模型小鼠。将乙肝疫苗单独或和CpG ODN或CpG ODN纳米粒经后腿胫骨前肌注射到小鼠体内,ELISA方法检测抗HBsAg IsG抗体、IL-12水平;流式细胞仪检测外周血CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群。结果:CpG ODN纳米粒联合疫苗组的CD4^+细胞百分数,IL-12水平及抗HBsAg IgG抗体的含量显著高于CpG ODN联合疫苗组(P<0.05)。结论:包裹在壳聚糖纳米粒中的CpG ODN较相同剂量的CpG ODN更能增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答。

外泌体联合CpGODN免疫刺激佐剂诱导CTL抗白血病效应

为了探讨外泌体(exosomes)作为白血病治疗性疫苗的可行性,体外研究了外泌体联合CpG佐剂诱导CTL杀伤白血病细胞的作用。获取正常人外周血MNC-DC,并分为7组,其中3组分别加入K562细胞来源外泌体(Kexo)、K562细胞诱导分化树突状细胞来源外泌体(DCexo)及K562细胞冻融抗原冲击K562细胞诱导分化树突状细胞来源外泌体(FTexo)作为实验组(分别为Kexo、DCexo和FTexo);另外3组在加入Kexo、DCexo和FTexo的同时加入CpG ODN佐剂也作为实验组(Kexo+CpG、DCexo+CpG和FTexo+CpG);第7组作为空白对照组。所有7组DC再继续培养3天,然后加入同源正常人T淋巴细胞共同培养3天,诱导T淋巴细胞为效应细胞(CTL),K562细胞为靶细胞,用MTT法测CTL对K562细胞的杀伤活性。结果显示:各外泌体实验组刺激诱导的CTL的杀伤作用比对照组明显增强(p<0.05)。DCexo及FTexo诱导的CTL对K562靶细胞的杀伤作用比Kexo强(p<0.05),联合应用GPGODN佐剂可以进一步增强这种杀伤作用(p<0.05)。结论:外泌体能诱导有效的CTL对白血病靶细胞的杀伤作用,CPGODN佐剂能进一步增强这种杀伤作用,外泌体有望作为治疗性疫苗用于白血病的临床治疗。

CpG-ODNs对慢性哮喘小鼠气道重塑的影响及机制

目的探讨疫苗佐剂CpG-ODNs对慢性哮喘气道重塑的影响及机制。方法采用卵蛋白(OVA)致敏并激发制备哮喘小鼠气道重塑动物模型,给予CpG-ODNs、GpC-ODNs干预,与生理盐水对照组、哮喘气道重塑模型组比较,观察其对哮喘气道重塑病理、肺泡灌洗液白细胞分类计数、细胞因子以及外周血免疫球蛋白的影响。结果模型组小鼠可见气道壁炎症细胞浸润、上皮下胶原沉着、平滑肌增殖和杯状细胞增生等慢性哮喘气道重塑的病理改变,血清OVA特异性IgE上升明显(P<0.01),支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒细胞及IL-4升高(P<0.01),CpG-ODNs部分抑制了上述病理过程(P<0.05),同时轻度升高IFN-γ及IL-10。GpC-ODNs对上述过程无明显影响。结论 CpG-ODNs能够通过上调Th1/Th2比例以及诱导调节性T细胞(Treg细胞)介导的免疫耐受,发挥对慢性哮喘气道重塑的防治作用。

CpG ODN107增强人脑胶质瘤细胞放射敏感性的研究

目的探讨CpG ODN107增加人脑胶质瘤细胞(CHG-5)放射敏感性的作用及可能机制。方法用不同浓度CpG ODN107处理CHG-5细胞,然后经放射线照射,MTT法检测细胞的增殖情况,体外培养集落形成率与细胞划痕法观察细胞的集落形成和迁移能力,ELISA法检测细胞TNF-α的分泌水平。结果CpG ODN107抑制CHG-5细胞的增殖,并呈量效关系。CpG ODN107(10μg/mL)联合放射线照射,抑制CHG-5细胞的增殖作用最强(0.52±0.76)。CpG ODN107(10μg/mL)同样能抑制CHG-5细胞增殖和迁移,并且增加了TNF-α的分泌,在联合照射后作用更加显著(193±0.58)pg/mL。结论CpG ODN107对CHG-5有明显的放射增敏作用,其机制可能与CpG ODN107增强肿瘤细胞TNF-α的分泌有关。

CpG ODN增强乙型肝炎表面抗原免疫小鼠的抗体产生

目的 :探讨合成含CpG基序的寡核苷酸 (CpGODN)对重组乙型肝炎表面抗原 (rHBsAg)及乙型肝炎疫苗增强小鼠特异性抗体产生的效应。方法 :采用非纯系 (Km)及纯系 (Balb c)小鼠作为免疫对象 ,经后腿胫骨前肌免疫 2次 ,ELISA法检测血清乙型肝炎表面抗体 (抗 HBs)效价。结果 :加CpGODN组 ,其抗 HBs效价均较单独注射rHBsAg和疫苗组明显增高 ,持续时间长 ,且纯系鼠的抗体效价明显高于非纯系鼠。结论 :CpGODN对小鼠抗 HBs产生具有增强作用 ,且与疫苗中的铝佐剂有协同效应。

CpG ODN对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠动物模型的免疫治疗作用

目的 探讨Cp G ODN对呼吸道合胞病毒诱导的哮喘小鼠动物模型的免疫治疗作用。方法 用紫外线灭活的呼吸道合胞病毒致敏30只BAL B/ c小鼠后,分别注射生理盐水、地塞米松和Cp G ODN,流式细胞仪检测小鼠的外周血T淋巴细胞亚群,EL ISA法检测小鼠的外周血IL - 4、IFN-γ和总Ig E的含量,并观察肺组织病理变化。结果 Cp G组CD4 +T细胞所占百分比为( 6 9.35±6 .15 ) % ,CD4 +/ CD8+的比值为2 .92±0 .35 ,与哮喘模型组相比显著降低( P<0 .0 5 )。Cp G组IL- 4的含量为( 88.96±9.89) pg/ ml,与哮喘模型组相比明显降低( P<0 .0 5 ) ;IFN-γ的含量为( 4 6 .83±8.84 ) pg/ ml,与哮喘模型组相比显著上升( P<0 .0 5 ) ;总Ig E的含量为( 3.72±0 .6 7) IU/ml,与哮喘模型组相比明显降低( P<0 .0 5 )。肺组织炎症反应明显减轻。结论 Cp G

CpG ODN增强免疫力低下小鼠对乙肝疫苗的体液免疫应答

目的 探讨CpGODN对免疫力低下小鼠的体液免疫增强作用。方法 选用老年C57BL/ 6小鼠和免疫抑制模型小鼠 ,将重组HBsAg疫苗和CpGODN同时或单独肌注到小鼠体内 ,2周后以同样剂量加强免疫 1次 ,再过 3周后摘除眼球取血 ,用ELISA方法检测抗HBsAgIgG抗体。 结果 免疫抑制模型中同时注射CpGODN和疫苗组产生的IgG抗体绝对量是单独注射疫苗组的 2倍 ;老年鼠组中 1 0 μg和2 0 μgCpGODN与疫苗同时注射组产生的IgG抗体绝对量分别是单独注射疫苗组的 3倍和 4倍。

诃子抗CPG ODN组分的分离及活性评价

目的:从诃子中分离制备具有拮抗CPG ODN作用的活性组分。方法:应用水提、离子色谱技术等方法,从诃子中分离制备具有拮抗CPG ODN活性的组分;并应用生物传感器技术,对所得到的组分进行与CPG ODN结合活性的筛选;观察其对CPG ODN刺激的小鼠RAW 264.7细胞释放炎症介质的抑制作用。结果:应用生物传感器技术筛选出与CPGODN结合活性最高的诃子作为研究对象,应用离子色谱技术从诃子中分离出3组分,其中有3个组分均具有一定的与Lipid A的结合活性,以第3组分与Lipid A的结合活性最强;并对CPG ODN刺激的小鼠RAW 264.7细胞释放TNF-α具有显著的抑制作用;结论:从诃子中分离出的第3组分具有显著的拮抗CPG ODN活性。

不同序列的CpG-ODN对猪体外免疫细胞免疫刺激作用的研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN),人工设计合成了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,分别作用于健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞,进行体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数(SI),筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激作用,其中CpG-ODN7对淋巴细胞增殖能力的增强效果最为明显(SI=3.5),CpG-ODN6对猪脾脏免疫细胞的刺激指数最大(SI=2.7)。为研制猪DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定了基础。

CpG-ODN对山羊实验性乳腺炎乳中NAGase、MPO及乳铁蛋白的影响

选择同处于泌乳初期的睢宁白山羊6头,产后第5、8天分别向左、右乳区灌注等体积的灭菌PBS和10μg.kg-1CpG-ODN(cytosine-phosphate-guanosine dinucleotides),第9天于左、右乳区经乳导管灌注大肠杆菌(2×109CFU.mL-1)和金黄色葡萄球菌(2×109CFU.mL-1)混合菌液3 mL。分别于灌注细菌前0 h,灌注后8、16、24、48和72 h采集乳样,动态监测乳中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)和髓过氧化物酶(MPO)的活力及乳铁蛋白含量变化。灌注72 h后处死动物,取乳腺组织进行组织学观察。结果显示:灌注细菌后72 h,灌注PBS的乳腺腺泡内仍有大量嗜中性粒细胞浸润,但灌注CpG-ODN的乳区已无明显细胞浸润。灌注CpG-ODN侧乳中NAGase、MPO活性均随时间变化先上升后下降,在24 h达到最大值,乳铁蛋白含量则在16 h达到最高。灌注PBS的侧乳中NAGase、MPO活性随时间变化表现出相同的规律,但NAGase峰值高于灌注CpG-ODN的一侧,MPO峰值低于灌注CpG-ODN的一侧;乳铁蛋白含量在24 h达到最大,峰值也有所升高。上述结果表明,CpG-ODN可以增强乳腺对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌联合感染诱导的山羊实验性乳腺炎的非特异性防御能力,减轻乳腺上皮细胞的损伤。

新型CpG ODN对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的:探讨我室自行设计的CpG ODN(CpG BW001)在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用。方法:CpGBW001刺激人外周血单个核细胞(PBMC)48小时,用VSV病毒保护实验及ELISA法检测培养上清的病毒保护能力及其中的IFNα-含量。将上述CpG BW001刺激人PBMC的上清与HepG2.2.15细胞共孵育12天后收集培养上清,用放射免疫法检测该培养上清液中HBsAg及HBeAg的含量,用点杂交法检测HBV DNA的含量。结果:CpG BW001刺激人PBMC产生以IFNα-为主的抗病毒物质;CpG BW001刺激人PBMC的培养上清作用于HepG2.2.15细胞后,HepG2.2.15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量明显减少,且细胞内HBV DNA的含量也显著降低。结论:CpG BW001能通过刺激细胞产生抗病毒物质如IFNα-等,从而在体外抑制HBsAg和HBeAg的表达及HBV的复制。

细胞因子IL-27和CpG ODN佐剂对呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗免疫效果的影响

目的研究细胞因子佐剂IL-27单独或与CpG2216佐剂联合使用对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白疫苗免疫效果的影响。方法将编码IL-27的质粒(以下简称IL-27)单独或与CpG2216佐剂作为联合佐剂与G1F/M2共免疫Balb/c小鼠3次,每次免疫10 d后取血,分离血清,用间接ELISA法测定3次免疫后的血清IgG抗体效价以及末次IgG1、IgG2a抗体效价。第3次免疫后2周处死小鼠,取脾细胞,用LDH法检测CTL活性、ELISPOT法检测分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞水平、流式细胞仪检测CD4^+、CD8^+的效应记忆和中央记忆T细胞。结果 ELISA结果表明:除PBS组外,各组均诱导了高水平的IgG抗体无显著性差异(P<0.05),IgG2a、IgG1分别为Th1和Th2型抗体,IL-27+G1F/M2组、IL-27+CpG2216+G1F/M2组IgG2a和IgG1的比值明显高于其他组,说明IL-27作为佐剂对G1F/M2所诱导的体液免疫应答无增强作用但可以调节免疫应答的类型,使免疫应答更平衡;CTL杀伤实验显示:IL-27^+CpG2216+G1F/M2组的CTL杀伤活性显著高于其他各组(P<0.05);ELISPOT结果显示:IL-27^+CpG2216+G1F/M2组中分泌IFN-γ的淋巴细胞数量显著高于其他组分泌IFN-γ的淋巴细胞数量,且各组分泌IFN-γ的淋巴细胞数量显著高于同组分泌IL-4的淋巴细胞数量(P<0.05),即均诱导了Th1型优势应答;流式细胞仪检测结果说明IL-27+G1F/M2组和IL-27^+CpG2216+G1F/M2组均能诱导产生大量的CD44^+CD62L^+双阳性细胞。结论细胞因子佐剂IL-27和CpG2216佐剂联合使用可以增强吸道合胞病毒重组疫苗诱导的细胞免疫应答而且IL-27对Th1型优势应答具有调节作用。

一种B型CpG ODN对乙肝疫苗的免疫佐剂作用

目的研究一种本室设计的B型CpG ODN(BW006)作为乙肝疫苗佐剂的可行性。方法以琼脂糖凝胶电泳法对BW006的质量进行初步检定;H3-掺入法检测BW006对小鼠脾细胞的刺激作用;乙肝疫苗与BW006联合免疫Balb/c小鼠,并用ELISA法检测小鼠血清中的HBsAb水平。结果BW006的纯度和完整性符合实验要求,并能显著的刺激小鼠脾细胞的增生,同乙肝疫苗联用后能够明显增强乙肝疫苗的免疫效果。结论BW006对乙肝疫苗有较强的免疫佐剂作用。

免疫佐剂作用机制及CpG ODN作为新型佐剂的研究

免疫佐剂通过免疫调节作用等5种方式发挥功能,借助佐剂的非抗原特异性的多克隆激活是天然免疫细胞可能的作用机制.大部分佐剂通过直接参与天然免疫事件而间接/直接影响获得性免疫应答,不同的佐剂可针对不同的事件发挥作用.CpG ODN作为佐剂的优势在新近的研究中被逐渐发现.