CpG-ODN对重离子辐射所致脾脏损伤的救治作用

本次研究主要探讨CpG-ODN对重离子辐射所致脾脏损伤的救治作用。实验中C57BL/6L小鼠受到5 Gy12C6+离子全身照射,在照射后急性期计算小鼠脾脏指数,苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色观察脾脏组织结构变化。另外,免疫组化法检测γ-H2AX蛋白含量以判断脾脏细胞DNA发生双链断裂(Double-strand break,DSB)情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediatedd UTPnickandlabeling,TUNEL)法检测脾脏细胞凋亡水平,荧光标记法检测外周血CD19+B细胞数量。结果显示,经12C6+离子照射后CpG-ODN处理,小鼠脾脏指数提高,脾脏红髓萎缩程度减轻,白髓面积增大,其内淋巴B细胞排列密度提高,发生DSB和凋亡的细胞数量减少,外周血CD19+B细胞数量增加。这些表明CpG-ODN能减轻12C6+离子照射后脾脏损伤,其原因可能与CpG-ODN抑制细胞发生DSB和凋亡有关。

不同序列的CpG-ODN对猪体外免疫细胞免疫刺激作用的研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN),人工设计合成了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,分别作用于健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞,进行体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数(SI),筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激作用,其中CpG-ODN7对淋巴细胞增殖能力的增强效果最为明显(SI=3.5),CpG-ODN6对猪脾脏免疫细胞的刺激指数最大(SI=2.7)。为研制猪DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定了基础。

CpG-ODN对乙肝核酸疫苗及重组疫苗免疫效果的影响

目的研究CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)对乙肝核酸疫苗及重组(CHO细胞)疫苗免疫效果的影响。方法核酸疫苗实验组用CpGODN与乙肝核酸疫苗联合免疫BALBc小鼠,阳性对照组注射核酸疫苗,阴性对照组注射质粒pVAX1;重组疫苗分4个实验组,用CpGODN与不同剂量的重组疫苗配伍后分别免疫BALBc小鼠,阳性对照组注射重组疫苗,阴性对照组注射生理盐水。应用ELISA检测小鼠血清中的抗HBs水平。结果CpG与乙肝核酸疫苗组抗体阳转率比阳性对照组提高3倍,抗体水平提高2倍。CpG与重组疫苗组的阳转率和阳转时间均高于或早于CpG与核酸疫苗实验组。加入CpGODN后,即使重组疫苗用量减少3倍,诱导抗体水平和阳转率均无明显改变。结论CpGODN可提高乙肝核酸疫苗和重组疫苗的免疫效果,并使抗体产生的时间提前。

CpG-ODNs对慢性哮喘小鼠气道重塑的影响及机制

目的探讨疫苗佐剂CpG-ODNs对慢性哮喘气道重塑的影响及机制。方法采用卵蛋白(OVA)致敏并激发制备哮喘小鼠气道重塑动物模型,给予CpG-ODNs、GpC-ODNs干预,与生理盐水对照组、哮喘气道重塑模型组比较,观察其对哮喘气道重塑病理、肺泡灌洗液白细胞分类计数、细胞因子以及外周血免疫球蛋白的影响。结果模型组小鼠可见气道壁炎症细胞浸润、上皮下胶原沉着、平滑肌增殖和杯状细胞增生等慢性哮喘气道重塑的病理改变,血清OVA特异性IgE上升明显(P<0.01),支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒细胞及IL-4升高(P<0.01),CpG-ODNs部分抑制了上述病理过程(P<0.05),同时轻度升高IFN-γ及IL-10。GpC-ODNs对上述过程无明显影响。结论 CpG-ODNs能够通过上调Th1/Th2比例以及诱导调节性T细胞(Treg细胞)介导的免疫耐受,发挥对慢性哮喘气道重塑的防治作用。

CpG-ODN对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞T-bet表达的影响

目的探讨T-bet在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的作用以及CpG-ODN对其表达的调节作用。方法应用半定量RT-PCR,对22例慢性乙型肝炎活动期患者、10例HBsAg阳性无症状携带者和12例正常对照外周血单个核细胞(PBMC)T-bet的表达进行检测;同时用CpG-ODN体外刺激以上3组实验对象的PBMC,RT-PCR观察T-bet的表达情况。结果无症状携带者T-bet表达最低,慢性乙型肝炎活动期患者T-bet表达最高;经CpG-ODN刺激后,无症状携带者和正常对照的T-bet表达明显上调。结论T-bet在HBV感染的不同状态中具有差异表达,提示T-bet可能参与了机体抗HBV的免疫应答,具体的机制有待进一步研究。CpG-ODN作为一种新型的免疫调节剂,可在一定程度上恢复HBV感染者特别是无症状携带者的Th1型细胞免疫应答。

壳聚糖基因载体增强CpG-ODN免疫活性研究

目的应用壳聚糖(CS)包载含CpG序列的寡脱氧核苷酸(ODN),制备CS CpG-ODN基因载体,并研究其免疫活性。方法采用复凝法制备CS Cp-ODN基因载体。24只小鼠随机分为4组,每组6只,包括对照组、CS组、CpG-ODN组和CS CpG-ODN组,均通过后大腿肌内注射进行免疫接种。用MTT法检测淋巴细胞增殖情况,ELISA方法检测血清中IgG、IL-2和IL-12水平,流式细胞仪检测外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群。结果免疫接种CS CpG-ODN能提高小鼠淋巴细胞增殖水平;血清中IL-2和IL-12的含量明显升高,能获得高水平的保护性IgG;同时外周血T细胞亚群分析显示,CS CpG-ODN能更有效上调CD4+T细胞百分比以及CD4+/CD8+比值。结论CS CpG-ODN基因载体能有效提高CpG-ODN免疫促进作用。

CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的抑制作用

目的明确抑制性CpG ODN 208(CpG-N ODN)对刺激性CpG ODN 1826(CpG-S ODN)诱导单核/巨噬细胞分泌TNF-α的影响,为通过拮抗细菌DNA达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法选用本室前期筛选出的对CpG-S ODN活化RAW 264.7细胞有抑制作用的CpG-N ODN,观察其对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的影响;应用流式细胞术观察CpG-NODN对CpG-S ODN与hPBMC表面结合和内化的影响。结果浓度比为1∶1的CpG-N ODN对刺激性CpG-S ODN诱导hPBMC分泌TNF-α具有抑制作用,并呈一定时效关系;CpG-N ODN对CpG-S ODN在hPBMC细胞表面的结合和内化具有抑制作用。结论CpG-N ODN对CpG-S ODN活化hPBMC具有抑制作用,这个作用可能与其影响hPBMC的表面结合和内化CpG-S ODN有关。

CpG-ODN对哮喘小鼠Th1/Th2相关细胞因子表达的影响

目的 探讨CpG ODN对哮喘小鼠Th1/Th2相关细胞因子的调节作用及气道炎症的抑制作用。方法 采用酶联免疫吸附法 (ELISA)分别检测CpG ODN对哮喘小鼠抗原首次激发后 2 4小时和抗原末次激发后 2 4小时血清及支气管肺泡灌洗液 (BALF)中Th2细胞因子IL 4和Th1细胞因子IFNγ水平的影响 ,并与激素治疗组和哮喘组对照。结果 (1)抗原末次激发后 2 4小时 ,CpG ODN组血清及BALF中IFNγ水平高于哮喘组及地塞米松组 (P <0 0 0 1)。 (2 )抗原首次激发后 2 4小时及抗原末次激发后 2 4小时血清和BALF中IL 4水平低于哮喘组 (P <0 0 5 ) ,与地塞米松组比较无显著性差异 (P >0 0 5 )。 (3)抗原末次激发后 2 4小时 ,CpG ODN组外周血和BALF中嗜酸性粒细胞计数均低于哮喘组 (P <0 0 0 1)。结论 CpG ODN不仅具有与地塞米松相同的下调Th2细胞因子表达和抑制嗜酸性粒细胞的作用 ,而且还具有地塞米松所没有的诱导Th1细胞因子表达的作用。

CpG-ODN活化人NK细胞的初步研究

目的:研究D型CpG-ODN对人免疫细胞的活化效应。方法:CpG-ODN体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC),ELISA检测培养液IFN-α及IFN-γ的含量;RT-PCR检测PBMC中TLR9的表达水平;MTT法观察活化的NK对K562的杀伤作用。结果:CpG-ODN有效诱导PBMC分泌IFN-α和IFN-γ,增强活化的NK细胞对K562细胞的杀伤作用,且能显著上调TLR9mRNA的表达。结论:在TLR9的介导下,CpG-ODN能有效激活NK细胞,参与机体免疫调节。

CpG-ODN对小鼠骨髓造血系统辐射损伤的保护作用

目的探讨Toll样受体9(Toll-like recptor 9,TLR9)激动剂———含CpG基序的寡核苷酸(CpG-ODN)对小鼠骨髓造血系统辐射损伤的治疗作用。方法小鼠在照射后30 min、24 h、48 h连续腹腔注射CpG-ODN(50μg/只),观察小鼠不同剂量照射后存活率的变化,检测特定时间内血液中白细胞和骨髓中有核细胞的含量及其骨髓病理切片,外源性脾结节集落形成数。结果 CpG-ODN能提高照后小鼠的存活率,提高小鼠外周血白细胞和骨髓有核细胞数(P<0.01),缓解骨髓病理学的损伤,减少骨髓干细胞的死亡。结论 CpG-ODN能减轻小鼠骨髓造血系统辐射损伤。

CpG-ODN2216刺激健康人外周血淋巴细胞T_H1/T_H2细胞因子的表达

目的观察CpG-ODN2216对健康人外周血单个核细胞(PBMC)中TH1/TH2淋巴细胞的极化作用,以及培养上清液中TH1/TH2型细胞因子的水平。方法取健康献血员外周血用淋巴细胞分离液分离PBMC,与CpG-ODN2216共培养24h,流式细胞仪检测PBMC中TH1/TH2淋巴细胞的改变,ELISA法测定培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的释放水平。结果CpG-ODN2216能刺激淋巴细胞向TH1、Tc1转化,对TH2无明显的刺激作用。培养上清液中IFN-γ的表达水平显著增高(P<0.01),IL-2、IL-4和IL-10无明显改变(P>0.05)。结论CpG-ODN2216可以促进外周血淋巴细胞向TH1、Tc1极化,并诱导PBMC产生高水平的TH1型细胞因子IFN-γ,介导TH1型免疫应答。

黏膜佐剂mLT63及CpG-ODN鼻内免疫的佐剂作用

目的研究大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63和CpG-ODN鼻内免疫对抗原的佐剂效应。方法选用破伤风类毒素(TT)和小牛血清白蛋白(BSA)为抗原,mLT63和CpG-ODN为佐剂,经鼻内免疫BALB/c小鼠。ELISA间接法检测免疫小鼠血清和肺、直肠及阴道组织萃取液的特异性抗TT、BSA的IgA、IgG水平。结果mLT63和CpG-ODN均能协助TT和BSA抗原在血清、肺、阴道、直肠组织中诱导出高滴度的IgG抗体。在血清中IgA抗体滴度均比较低,而TT-IgA在肺和阴道组织中滴度较高,BSA-IgA在肺组织中滴度较高。各佐剂组之间IgG和IgA抗体水平相比,差异均无显著意义。不同剂量的mLT63诱导的BSA-IgA抗体水平差异无显著意义。结论mLT63和CpG-ODN经鼻内免疫对TT和BSA抗原均有良好的佐剂作用。

CpG-ODN对山羊实验性乳腺炎乳中NAGase、MPO及乳铁蛋白的影响

选择同处于泌乳初期的睢宁白山羊6头,产后第5、8天分别向左、右乳区灌注等体积的灭菌PBS和10μg.kg-1CpG-ODN(cytosine-phosphate-guanosine dinucleotides),第9天于左、右乳区经乳导管灌注大肠杆菌(2×109CFU.mL-1)和金黄色葡萄球菌(2×109CFU.mL-1)混合菌液3 mL。分别于灌注细菌前0 h,灌注后8、16、24、48和72 h采集乳样,动态监测乳中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)和髓过氧化物酶(MPO)的活力及乳铁蛋白含量变化。灌注72 h后处死动物,取乳腺组织进行组织学观察。结果显示:灌注细菌后72 h,灌注PBS的乳腺腺泡内仍有大量嗜中性粒细胞浸润,但灌注CpG-ODN的乳区已无明显细胞浸润。灌注CpG-ODN侧乳中NAGase、MPO活性均随时间变化先上升后下降,在24 h达到最大值,乳铁蛋白含量则在16 h达到最高。灌注PBS的侧乳中NAGase、MPO活性随时间变化表现出相同的规律,但NAGase峰值高于灌注CpG-ODN的一侧,MPO峰值低于灌注CpG-ODN的一侧;乳铁蛋白含量在24 h达到最大,峰值也有所升高。上述结果表明,CpG-ODN可以增强乳腺对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌联合感染诱导的山羊实验性乳腺炎的非特异性防御能力,减轻乳腺上皮细胞的损伤。

CpG-ODN对婴幼儿喘息性支气管炎外周血单个核细胞T-bet表达的影响

目的:探讨CpG-ODN干预对婴幼儿喘息性支气管炎外周血单个核细胞(PBMC)T-bet表达和IFN-γ分泌的影响。方法:对28例喘息性支气管炎(喘支组)患儿于急性期和恢复期分别抽取抗凝静脉血并分离PBMC,以终浓度为10μg/ml的B型CpG-ODN刺激48小时,分别应用RT-PCR和Western blot检测CpG-ODN刺激前后患儿PBMC的T-bet mRNA和蛋白表达情况,以ELISA检测PBMC培养上清IFN-γ的变化,同时设立26例健康婴儿对照组。结果:与正常对照组比较,喘支患儿PBMC表达T-bet mRNA及蛋白明显减少(P<0.05),应用CpG-ODN刺激后,两组小儿PBMC表达T-bet均显著上调,但产生IFN-γ无明显增多,对照序列ODN对T-bet表达及IFN-γ的分泌无明显影响。相关分析表明,喘支患儿T-bet mRNA与IFN-γ分泌呈正相关(r=0.57,P<0.01),CpG-ODN刺激后,二者相关性明显下降(r=0.19,P>0.05)。结论:T-bet在喘支患儿PB-MC中表达减少,提示T-bet表达缺陷参与了喘支的免疫病理,B型CpG-ODN作为一种免疫调节剂,可有效上调T-bet的表达,但不能诱导IFN-γ的产生。

CpG-ODN 2006对斑马鱼抗创伤弧菌感染的作用

为创建环境友好的免疫预防技术,分析CpG-ODN对斑马鱼抗创伤弧菌感染的作用,采用PBS(对照)和人工合成的CpG-ODN 2006(试验组)序列分别注射斑马鱼,48h后创伤弧菌FJ03-X2进行攻毒,收集斑马鱼的肠道和肾脏组织提取RNA,逆转录成cDNA,通过Real-time RT-PCR检测相关基因的表达。结果表明,24h后CpG-ODN2006组的免疫保护率高达70.0%;相关免疫基因表达检测结果发现CpG-ODN 2006组肠道中lysozyme、Myd88、tlrs和tnf的mRNA水平显著下调,而il1b和il10则显著上调;肾脏中的基因表达差异更为明显:lysozyme显著上调,il1b、myd88、tnf、ifng1-2、il10、il22均显著下调。结果表明CpG-ODN 2006通过调节斑马鱼肾脏及肠道中非特异性免疫相关基因的表达,维持免疫系统的平衡,增强抗创伤弧菌FJ03-X2感染的能力。

3种类型CpG-ODN对哮喘小鼠Th1/Th2细胞因子IL-4、IFN-γ表达的影响

目的通过研究3种类型的CpG-ODN对哮喘小鼠Th1/Th2相关细胞因子表达的影响,探讨CpG-ODN治疗支气管哮喘的可能机制。方法以鸡卵蛋白(OVA)免疫小鼠建立哮喘模型,CpG-ODN干预组分为C1、C2、C3组,分别给予3种CpG-ODN腹腔注射,观察小鼠肺组织病理改变,支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数、嗜酸性粒细胞数的变化;ELISA法检测BALF及血清中IL-4和IFN-γ的含量变化。结果3个CpG-ODN干预组病理改变较模型组轻,但3组之间镜下观无差别;3组CpG-ODN干预后BALF中细胞总数和EOS计数及IL-4均低于哮喘组,C3组最低(P<0.01),C1组与C2组之间无明显差异(P>0.05);3组CpG-ODN干预后的IFN-γ浓度均高于B组,C3组最高,C1组高于C2组(P<0.01)。结论3种类型的CpG-ODN对哮喘小鼠气道炎症反应及Th1/Th2失衡均有较好的逆转作用,由于结构及活性特点,C型CpG-ODN较A、B型效果更好。

不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞免疫刺激作用的研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN),设计了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,通过人工合成,分别作用于猪外周血淋巴细胞和脾细胞,进行健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数(SI),筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激效果,其中CpG-ODN6、CpG-ODN7刺激强度极显著。为研制DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定基础。

CpG-ODN增强表达犬瘟热病毒H蛋白重组质粒免疫效果的分析

为提高犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)重组质粒的免疫应答水平,合成4条CpG-寡脱氧核苷酸(CpG-oligodeoxynueleotides,CpG-ODN);通过体外淋巴细胞增殖试验确定1条刺激活性最显著的CpG-ODN,序列为5-′TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′。将30只健康毕格犬随机均分为2大组,每大组再分为5小组,分别以不同的剂量肌肉注射CDV附着蛋白(H)重组质粒pcDNA-H和选定的CpG-ODN。在免疫后的第2、4、6周分别测定各组动物的抗CDV中和抗体和γ-干扰素水平。结果表明选定的CpG-ODN对提高抗CDV中和抗体效价和干扰素水平具有一定作用,且与对照组差异显著(P<0.05);但不同剂量的质粒pcDNA-H和CpG-ODN的效果不同,其中以30μg/只的CpG-ODN和50μg/只的pcDNA-H的剂量组合效果最佳。以选定剂量的CpG-ODN和pcDNA-H免疫5只健康毕格犬,同时以质粒pcDNA-H与生理盐水作为对照;4周后所有动物均接种CDV组织匀浆毒。结果发现试验组动物均未出现犬瘟热临床症状,且攻毒后第3周CDV检测为阴性,而pcDNA-H对照组和生理盐水对照组动物的CDV检测阳性率为2/5和5/5;这表明CpG能够明显促进重组质粒pcDNA-H的免疫保护作用。

CpG-ODN可增强痘苗病毒修饰的癌溶物的抗肿瘤效果

目的 :研究CpG联合非复制重组痘苗病毒在肿瘤免疫治疗中的效果。方法 :构建非复制重组痘苗病毒v△ 11β75 ,联合应用免疫刺激寡核苷酸和重组痘苗病毒v△ 11β75进行肿瘤免疫治疗。 结果 :重组痘苗病毒v△ 11β75在人源 143细胞中的不能正常繁殖 ,Southern blot证实痘苗病毒天坛株HindⅢC ,K片段间基因的缺失。在Wistar大鼠的Walker′s肿瘤模型中 ,联合应用CpG ODN和非复制痘苗病毒修饰的WRC2 5 6细胞裂解物进行免疫治疗 ,可以延长荷瘤鼠的生存期 ,肿瘤生长速度降低。结论 :CpG ODN可以增强非复制痘苗病毒修饰的肿瘤细胞裂解物的抗肿瘤治疗效果 ,为肿瘤免疫治疗提供了一种新的途径。

CpG-ODN对S.aureus诱导的山羊实验性乳腺炎乳腺的保护作用研究

选择同处于泌乳初期的睢宁白山羊6头,于右乳区经过乳导管灌注10μg/kgCpG-ODN,左乳区则灌入等体积的灭菌100μL0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照,灌注后第3d按同等剂量进行二次灌注,二次灌注后第2d,分别于左右乳区经乳导管灌注3mL(2×109CFU/mL)金黄色葡萄球菌(S.aureus),于灌注细菌前(0h),灌注后8h,16h,24h,48h和72h分别收集左右乳区乳汁进行检测。临床症状观察显示,乳腺内灌注3mL(2×109CFU/mL)的S.aureus能迅速诱导山羊典型的急性乳腺炎症状。组织学观察显示感染S.aureus后72h乳腺腺泡内仍有嗜中性粒细胞(PMN)浸润,但实验乳区明显减少。乳汁S.aureus数同在感染后24h上升至最高,CpG-ODN能显著降低各个时间点乳汁细菌数。乳汁白细胞介素-6(IL-6)水平同在感染后24h上升至最高,CpG-ODN能显著提高感染后24h乳汁IL-6水平。对照和CpG-ODN处理乳区乳汁肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平分别在感染后24h和16h上升至最高,其中在感染后24h实验乳区比对照下降40.63%(P<0.05)。乳汁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)水平同在感染后16h达最高(P<0.01),CpG-ODN能显著提高感染后8h乳汁NAGase水平。上述结果表明CpG-ODN可通过提高乳汁IL-6水平、加速并促进乳汁TNF-α的释放,从而减少了乳汁中S.aureus数量,减轻了炎症介质对细胞的损伤,对缩短炎症过程也有一定的作用,实验结果证实了CpG-ODN对S.aureus感染诱发的山羊乳腺炎的乳腺有保护作用。