多聚胺胆固醇阳离子脂质体介导CpGODN雾化吸入对哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞的影响

目的探讨雾化吸入多聚胺胆固醇阳离子脂质体(PCL)与CpGODN复合物(CpGODN/PCL复合物)对哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞(EOS)的影响。方法采用卵蛋白激发法建立哮喘小鼠模型,并设置正常对照组、哮喘对照组、CpGODN/PCL干预组、CpGODN干预组,每组6只。在雾化PCL介导转染CpGODN 48h后,分离小鼠左肺组织,切片HE染色,显微镜下检测EOS浸润情况,同时检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞浸润情况。结果用卵蛋白激发法成功地制备了哮喘小鼠模型。哮喘对照组肺组织肺泡腔黏液分泌增加,支气管及血管周围大量炎性细胞浸润,以EOS、淋巴细胞为主,与正常对照组比较,BALF中细胞总数、EOS数目和百分率均明显增加(P<0.01)。而与哮喘对照组比较,CpGODN干预组细胞总数,EOS数目和百分率显著下降(P<0.01)。CpGODN/PCL干预组与CpGODN干预组比较,细胞总数无统计学差异,EOS数目、百分率的差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论哮喘小鼠肺组织EOS浸润和气道黏液分泌,雾化介导CpGODN干预哮喘小鼠模型可减轻以EOS为特征的炎症反应,利用PCL为转染载体包裹CpGODN,可提高转染效率。

CpGODN对哮喘小鼠肺组织GITR/GITRL表达的影响

目的观察CpGODN干预对哮喘小鼠肺组织GITR及GITRL表达的影响。方法 48只SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照组(简称对照组),哮喘模型组(简称模型组),地塞米松治疗组,CpGODN治疗组。以卵清白蛋白(OVA)致敏和激发建立小鼠哮喘模型。观察肺组织病理;对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类及计数;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化检测肺组织中GITR、GITRL的表达。结果 BALF中嗜酸性粒细胞平均(x±s,下同)计数:CpGODN组为(2.76±0.25)×107/L,地塞米松组为(1.05±1.72)×107/L,均低于模型组的(12.09±2.62)×107/L,差异有统计学意义(P<0.01),CpGODN组与地塞米松组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR、免疫组化结果:CpGODN组与地塞米松组GITR、GITRL表达高于模型组,差异有统计学意义(P均<0.05),CpGODN组GITRL mRNA、GITR蛋白表达高于地塞米松组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析:肺组织GITR与GITRL表达呈正相关(P<0.01,n=40)。结论 CpGODN能改善哮喘小鼠气道炎症,显著增强哮喘小鼠模型中GITR及GITRL在肺组织中的表达。

CpGODN对尘螨哮喘小鼠Foxp3表达的影响

目的研究CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)对尘螨哮喘小鼠Th1/Th2型细胞因子及肺组织中Foxp3蛋白表达的影响。方法用雌性C57BL/6J小鼠建立尘螨哮喘小鼠模型,在抗原致敏阶段加入CpGODN进行干预,并设立GpCODN治疗对照组及布地奈德治疗对照组,观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)的变化;用酶联免疫吸附(ELISA)法检测BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ的含量变化;用免疫印迹(Western-blot)法检测肺组织Foxp3蛋白的表达水平。结果与哮喘模型组及GpCODN治疗对照组比较,CpGODN治疗组的BALF中IL-4、IL-5的浓度降低,IFN-γ浓度升高,肺组织中Foxp3蛋白表达增高;相关性分析显示肺组织Foxp3表达与BALF中IFN-γ水平呈正相关,与BALF中IL-4、IL-5水平、EOS绝对值均呈负相关。结论 CpGODN能够改善尘螨哮喘小鼠气道炎症,调节Th1/Th2型细胞因子的平衡,可能是通过诱导Foxp3的表达来起到免疫调节的作用。

CpGODN对尘螨哮喘小鼠T-bet/GATA-3表达的影响

目的探讨CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)对尘螨哮喘小鼠Th1/Th2型细胞因子的影响及其机制。方法用雌性C57BL/6J小鼠建立尘螨哮喘小鼠模型,在抗原致敏阶段加入CpGODN进行干预,并设立GpCODN治疗对照组及布地奈德治疗对照组,观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(EOS)数量的变化;用酶联免疫吸附(ELISA)法检测BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ的含量变化;用免疫印迹(Western blotting)法检测肺组织T-bet和GATA-3蛋白的表达水平。结果与哮喘模型组及GpCODN治疗对照组比较,CpGODN治疗组的BALF中炎症细胞明显减少,IL-4、IL-5的浓度降低,IFN-γ浓度升高,肺组织中GATA-3蛋白表达降低,T-bet表达增高;与布地奈德治疗组比较,CpGODN治疗组的BALF中IFN-γ浓度升高。相关分析显示肺组织中T-bet/GATA-3比值与BALF中IFN-γ/IL-4比值呈正相关。结论 CpGODN可通过诱导T-bet表达、抑制GATA-3表达以恢复Th1/Th2平衡,从而减轻尘螨过敏性哮喘小鼠的气道炎症。

CD_3单抗、CD_(28)/CpGODN共刺激活化的PBMC对膀胱癌细胞杀伤作用的研究

目的 探讨CD3单克隆抗体与CD2 8/CpGODN共刺激活化PBMC在体外对膀胱癌细胞株T2 4 及Scarber杀伤强度及杀伤作用机理。为膀胱癌的过继免疫治疗提供新的效应细胞。方法 MTT法检测活化细胞的体外淋巴细胞毒作用 ,并用电镜观察效应细胞杀伤膀胱癌细胞的超微结构。结果 CD2 8共刺激细胞对T2 4 杀伤作用较强 ,达到 69.35 %± 1 .1 7% ,而CpGODN诱导的活化细胞对Scarber杀伤较强 ,达到 63.1 1 %± 2 .0 3%。且效应细胞 :靶细胞均需达到 2 0 :1才达到半数杀伤作用。电镜结果显示 ,效应细胞作用 6小时肿瘤细胞就大部分发生坏死 ,部分肿瘤细胞可见凋亡 ,说明效应细胞是通过诱导肿瘤细胞坏死及凋亡实现杀伤作用的。结论 CD2 8单抗协同诱导的效应细胞对T2 4 杀伤效果较好 ,而CpGODN刺激细胞对Scarber杀伤较强 ,活化的淋巴细胞杀伤膀胱癌细胞是通过坏死及凋亡两条途径来实现的。

人Toll样受体9结合CpGODN结构域的研究

目的：脓毒症的发生与单核／吞噬细胞的Toll样受体（Toll--like receptors，TLRs）识别菌体成分后导致多种炎症细胞因子的大量释放密切相关，

CpGODN结合CD28/CD80单抗活化T细胞对结肠癌细胞的杀伤作用

目的研究联合应用CpGODN和CD28/CD80单抗共刺激健康人外周血T淋巴细胞(PBLs)在体外对结肠癌细胞株HT-29的杀伤作用,为结直肠癌的过继免疫治疗可能性提供参考。方法PBLs的分离与体外培养;CD28/CD80共刺激活化PBLs;用含共刺激活化PBMC或/和CpGODN的100ml/L胎牛血清的RPMI1640培养基培养细胞,测生长曲线。MTT法检测活化细胞的体外淋巴细胞毒作用,并用电镜观察效应细胞杀伤的结肠癌细胞超微结构及用流式细胞仪检测结肠癌细胞的相关凋亡情况。结果CpGODN本身对HT-29细胞有一定的杀伤作用(P<0.05),CD28/CD80共刺激活化PBLs在体外对结肠癌细胞株HT-29杀伤作用明显(P<0.01),CpGODN与CD28/CD80共刺激活化PBLs合用,对HT-29的杀伤作用显著大于CpGODN单独对HT-29细胞杀伤作用(抑制率92.31%vs68.00%,P<0.01),亦大于单独应用CD28/CD80共刺激活化PBMC对HT-29细胞的杀伤作用(P<0.05),CpGODN增加了HT-29细胞对共刺激活化PBMC的敏感性。电镜结果显示,效应细胞作用24h肿瘤细胞就部分发生坏死,部分肿瘤细胞可见凋亡。流式细胞仪检测效应细胞HT-29细胞72h明显凋亡。结论联合应用CpGODN可以提高单抗协同诱导的效应细胞对结肠癌细胞株HT-29杀伤作用,而坏死细胞进一步增多说明效应细胞是通过诱导肿瘤细胞坏死及细胞凋亡两条途径来实现抑制杀伤作用从而说明活化的淋巴细胞杀伤结肠癌细胞是通过坏死及凋亡实现的。

CpG ODN增强猪囊尾蚴病疫苗免疫反应的试验研究

依据CpG基序的生物学和免疫学特性 ,人工设计合成了硫代修饰的多种CpGODN序列 ,通过兔、小鼠和猪体进行了与铝胶、2 0 6佐剂和蜂胶佐剂的配伍和比较试验 ,用ELISA法测定加单一佐剂或联合佐剂组疫苗诱导的抗猪囊尾蚴病的抗体含量 (IgG或IgG2a)和效价 ,用MTT淋巴细胞转化试验法测定刺激指数 ,进一步证实了CpG基序的种类、数量和空间结构以及与其他佐剂联合对疫苗免疫反应的影响 ,CpG基序以 1个TpC的 5′端开始 ,紧接着 3个GTCGTT基序 ,基序与基序之间由TpT或T分隔 ,在兔、小鼠和猪都能诱导机体产生强烈的免疫反应特别是细胞免疫反应。

负载GST抗原的树突状细胞疫苗联合CpG ODN抗日本血吸虫感染的保护性研究

目的研究负载GST抗原的树突状细胞(DC)疫苗联合非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpGODN)免疫小鼠抗日本血吸虫感染的作用。方法将GST抗原纯化后负载树突状细胞株DC2.4,免疫荧光染色法检测GST的负载情况,并进行动物保护性实验。35只C57BL/6小鼠随机均分7组(每组5只),分别作免疫注射:A组为未处理的DC,B组为牛血清白蛋白(BSA)处理的DC,C组为GST负载的DC,D组为GST+CpGODN共刺激的DC,E组为CpGODN刺激的DC,F组为GST蛋白,G组为空白对照组。A～E各组DC经0.25%胰蛋白酶消化后用PBS调整密度至107/ml,每鼠皮下注射0.1ml,每次间隔2周,共免疫3次。F组首次每鼠免疫50μgGST蛋白加福氏完全佐剂,第2、3次分别免疫50μg、10μgGST蛋白加福氏不完全佐剂,均为皮下注射。各组于末次免疫后10d收集血清,ELISA方法分析血清中的特异性抗体。各组小鼠于末次免疫后2周每鼠经腹部感染尾蚴30±1条。6周后剖杀小鼠,计算减虫率。结果 DC经GST负载后可在荧光显微镜下观察到抗GST的特异荧光,表明抗原已被DC摄取。各组小鼠免疫后,F组抗体水平最高,为2.1270±0.4115,另外C组(0.5552±0.0789)和D组(0.7150±0.0523)的抗体水平均高于G组(0.2358±0.0889),差异有统计学意义(P<0.05)。免疫后攻击感染,D组小鼠的减虫率最高为53.3%,其次为F组(24.0%)和C组(21.3%),但D组与两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CpGODN联合GST抗原负载的树突状细胞疫苗具有一定的抗日本血吸虫感染作用。

CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的抑制作用

目的明确抑制性CpG ODN 208(CpG-N ODN)对刺激性CpG ODN 1826(CpG-S ODN)诱导单核/巨噬细胞分泌TNF-α的影响,为通过拮抗细菌DNA达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法选用本室前期筛选出的对CpG-S ODN活化RAW 264.7细胞有抑制作用的CpG-N ODN,观察其对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的影响;应用流式细胞术观察CpG-NODN对CpG-S ODN与hPBMC表面结合和内化的影响。结果浓度比为1∶1的CpG-N ODN对刺激性CpG-S ODN诱导hPBMC分泌TNF-α具有抑制作用,并呈一定时效关系;CpG-N ODN对CpG-S ODN在hPBMC细胞表面的结合和内化具有抑制作用。结论CpG-N ODN对CpG-S ODN活化hPBMC具有抑制作用,这个作用可能与其影响hPBMC的表面结合和内化CpG-S ODN有关。

自然养殖水体投喂CpG ODN和表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗WSSV的免疫保护作用

用添加CpG寡聚核苷酸(CpG ODN)和表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母(VP28-yl)的饵料投喂凡纳滨对虾,进行田间中试实验。投喂30 d后进行WSSV感染实验,评估其对凡纳滨对虾的免疫保护作用。投喂实验结束后,CpG ODN投喂组对虾的相对增重率达到(65.8±7.8)%(P<0.05),这暗示CpG ODN可能具有促生长作用。WSSV攻毒后,CpG ODN和VP28-yl投喂组对虾中WSSV拷贝数与对照组相比均显著降低(P<0.05),相对免疫保护率分别可达到26.7%和36.7%。在投喂结束和WSSV刺激后,CpG ODN组对虾中的呼吸爆发水平均显著升高(P<0.05)。而在VP28-yl投喂组,WSSV引起的细胞凋亡则显著受到抑制(P<0.05)。此外,WSSV刺激后,STAT基因在CpG ODN组和VP28-yl组对虾中的表达水平均显著上调(P<0.05),分别在第5天和第3天达到最大值,而对照组中则显著下调。研究结果表明,CpG ODN和VP28-yl增强了凡纳滨对虾抗病毒免疫力,对养殖对虾病毒性疫病的防控具有显著作用,可以作为免疫增强剂添加在饵料中,具有在养殖生产中推广使用的前景。

不同CpG ODN对大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的研究

目的:筛选对大鼠骨髓间充质干细胞增殖具有影响作用的CpG ODN。方法:体外全骨髓贴壁法提取并纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代孵育12 h至完全贴壁,双盲法加入不同CpG ODN共孵育48 h,MTT比色法检测,不同大鼠重复实验3次,筛选促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的CpG ODN。结果:与PBS溶媒对照组相比,有4条CpG ODN对不同大鼠BMSCs均具有显著促增殖作用,MTT结果具有统计学意义(P<0.05)。结论:4条CpG ODN具有显著促进大鼠BMSCs增殖的作用,将在下一步的实验中探讨它们对BMSCs分化功能的作用。

CpG ODN对非小细胞肺癌患者化疗后免疫功能的影响

目的测定非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者化疗前后外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)经胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(cytosine-phosphorothioateguanine oligodeoxynucleotides,CpG ODN)刺激后,CD4+CD25highTreg细胞及IFN-γI、L-12的变化,评价不同时间点CpG ODN的干预效果。方法选取NSCLC患者20例,分别抽取患者化疗前(d0)、化疗后第3天(d3)及第7天(d7)外周血3 mL,分离PBMC。每份PBMC均分为实验组及对照组,实验组给予CpG ODN 2006刺激,对照组不做干预。经培养48 h后收集细胞以流式细胞仪检测CD4+CD25highTreg细胞百分比,并取上清液检测INF-γ和IL-12(pg/mL)。结果实验组CD4+CD25highTreg细胞百分比在d0、d3、d7分别为(2.22±0.66)%,(2.09±0.44)%和(2.08±0.48)%,较对照组均有明显下降(P<0.05)。实验组IFN-γ在d0、d3、d7分别为(40.64±5.90)、(40.57±5.80)和(45.30±4.78)pg/mL,d0和d7时较对照组显著增加(P<0.05),d3时变化不明显(P>0.05)。实验组IL-12在d0、d3、d7分别为(41.02±6.65)、(39.41±7.41)和(45.75±12.46)pg/mL,d0和d3时较对照组明显增加(P<0.05),而d7时变化不明显(P>0.05)。动态观察对照组,d3时CD4+CD25highTreg细胞比例下降至最低点,而后逐渐回升;实验组在d7时CD4+CD25highTreg细胞比例仍持续下降;实验组的IFN-γ值呈现升高趋势,d7和d0、d3相比明显升高(P<0.05);而实验组IL-12值在化疗前后无明显变化,即化疗前d0与化疗后d3、d7比较,以及d3与d7比较,差异均不明显(P值均>0.05)。肺癌患者化疗次数及外周血淋巴细胞的数目与CpG ODN对CD4+CD25highTreg细胞比例及IFN-γI、L-12的分泌作用无显著相关性(P>0.05)。结论 CpG ODN能有效下调CD4+CD25highTreg细胞,刺激INF-γ的分泌,优化肺癌患者抗肿瘤的免疫微环境,有利于机体的抗肿瘤免疫;肺癌患者即使化疗后外周血淋巴细胞的数目明显减少,CpG ODN仍能下调CD4+CD25highTreg细胞和刺激INF-r的分泌,发挥抗肿瘤作用。

鸭特异性CpG ODN体外抑制鸭坦布苏病毒复制的研究

为明确鸭特异性寡聚脱氧核苷酸(Cp G ODN)体外对鸭坦布苏病毒(DTMUV)复制的抑制作用,研究在Cp G ODN最佳活性分子筛选的基础上,与DTMUV感染后的细胞进行共孵育,分别采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法(MTT法)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测不同浓度Cp G ODN-D2对DTMUV复制的抑制作用。结果显示:对非洲绿猴肾(Vero)细胞来说,Cp G ODN-D2浓度在300μg/m L以内均为安全浓度;MTT法和q RT-PCR检测结果均表明,各浓度Cp G ODN-D2对DTMUV的复制均有一定的抑制作用,并随浓度升高呈现先上升后下降的趋势,其中30μg/m L的浓度效果最佳,达到84.74%。结果证实了Cp G ODN-D2作为新型免疫调节剂可有效抑制DTMUV的复制。

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的 Cp G ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗 HBs的影响 .方法 构建编码乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原蛋白 S的重组真核表达质粒p CR3.1- S作为 HBV基因疫苗 ,人工合成含 Cp G motif的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂 ,以 BAL B/ c小鼠作为实验动物进行免疫接种 ,采用 EL ISA法检测免疫小鼠的抗 HBs应答 .结果 与生理盐水作为佐剂组相比较 ,应用 Cp G ODN组小鼠产生更强的抗 HBs反应 (P<0 .0 5 ) .结论 Cp G ODN作为佐剂可促进 HBV基因疫苗诱导 BAL B/ c小鼠产生抗 HBs应答 .

包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂质体疫苗的免疫效果

非磷脂脂质体NovasomeR○(Np )是由Brij5 2、胆固醇和油酸组成 ,可作为同时传递佐剂和抗原的载体。我们将HBsAg与天然骨架CpGODN (phosphodiesterCpGODN ,pdCpGODN )包裹于Np后免疫BALB/c小鼠 ,检测其免疫效果。结果显示 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np在小鼠中诱导了很高滴度的抗 HBs抗体产生并诱生了HBsAgS2 8 3 9特异性的CTL ,而铝佐剂组和仅包裹HBsAg的Np组诱生的抗体滴度较低 ,未检测到CTL活力。抗体亚类分析结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np诱生的免疫应答类型与pdCpGODN剂量有关 ,较低剂量 (2 4 μgpdCpGODN )诱生的为IgG2a为主的Th1型应答 ,而较高剂量(4 7μgpdCpGODN )诱生的是Th1/Th2混合型应答。铝佐剂和仅包裹HBsAg的Np组诱生的是以IgG1为主的Th2型应答。此外 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np免疫小鼠脾淋巴细胞在体外HBsAg刺激培养后特异性增殖并分泌高水平的IFN γ。这些结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np能增强HBsAg的免疫原性 ,诱生体液 /细胞免疫均衡应答 。

含CpG寡脱氧核苷酸增强人肺癌细胞株A549放射敏感性的研究

目的探讨含CpG基序的寡脱氧核苷酸对人肺癌细胞株A549放射敏感性的影响。方法分别用不同浓度CpG ODN处理A549细胞,经β射线照射后,检测细胞增殖和集落形成情况,ELISA法检测细胞TNF-α、IL-12和INF-γ的分泌水平,G riess检测细胞NO的含量。结果 CpG ODN抑制A549细胞的增殖,并呈量效关系。CpG ODN(10μg/m l)联合β射线照射,抑制A549细胞的增殖作用最强,且增加了TNF-α、IL-12、INF-γ和NO的分泌。结论 CpG ODN对A549细胞有明显的放射增敏作用,其机制可能与CpG ODN抑制A549细胞增殖、增强TNF-α、IL-12、INF-γ和NO的分泌有关。

TLR9在胃癌细胞上的表达及其作用的实验研究

目的探讨TLR9在胃癌细胞MGC803上的表达及其激动剂对MGC803细胞增殖和凋亡的影响。方法用RT-PCR方法检测MGC803细胞上TLR9的表达;用TLR9的激动剂CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodexy-nucleotides,CpG-ODN)10μg.mL-1分别作用MGC803细胞24、48 h和72 h后,用MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术观察CpG ODN作用MGC803细胞24 h后的细胞凋亡现象。结果 MGC803细胞上有TLR9的表达;TLR 9激动剂CpG ODN作用于MGC803细胞不同时间点,均能明显抑制MGC803细胞生长(P<0.01),以早期凋亡为主。结论 TLR9激动剂CpG ODN对胃癌细胞的生长具有抑制作用。