10种CpG-ODNs对罗非鱼抗海豚链球菌感染的作用

采用人工合成的10种未甲基化CpG-ODNs序列分别注射健康的吉富罗非鱼Oreochromis niloticus,48 h后注射海豚链球菌(Streptococcus iniae)进行人工感染,分别于感染24 h和48 h后检测鱼体血清溶菌酶(Lysozyme,LSZ)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)的活性,并记录死亡率。结果显示:注射ODN-205的罗非鱼LSZ、AKP和SOD活性变化均不显著(P>0.05),推测注射ODN-205后罗非鱼能较好的维持机体的平衡,增强机体的抗菌能力;注射ODN-1681、1670、2133和2006的罗非鱼LSZ活性逐渐降低,而注射ODN-1826、2143、1668、2102、1669的罗非鱼LSZ活性呈现先升高后降低的趋势。AKP活性的变化趋势同LSZ活性变化大体相似,而SOD活性前后变化不显著(p值>0.05)。注射CpG-ODNs的实验组抑制海豚链球菌感染的作用差异显著(p值<0.05),其中以注射ODN-205组的死亡率最低(18%),其次为注射ODN-1670、1681、2006和2133组,死亡率均低于30%,而ODN-1669组和生理盐水组的死亡率均超过90%。实验表明,注射一定量的ODN-205、1670、1681、2006和2133能明显提高吉富罗非鱼抗海豚链球菌感染能力。

CpG ODNs临床应用前景

细菌基因组DNA和人工合成的CpG ODNs主要依赖其序列中CpG基序激活特异性和非特异性系统的细胞发生免疫应答.

CpG ODN增强猪囊尾蚴病疫苗免疫反应的试验研究

依据CpG基序的生物学和免疫学特性 ,人工设计合成了硫代修饰的多种CpGODN序列 ,通过兔、小鼠和猪体进行了与铝胶、2 0 6佐剂和蜂胶佐剂的配伍和比较试验 ,用ELISA法测定加单一佐剂或联合佐剂组疫苗诱导的抗猪囊尾蚴病的抗体含量 (IgG或IgG2a)和效价 ,用MTT淋巴细胞转化试验法测定刺激指数 ,进一步证实了CpG基序的种类、数量和空间结构以及与其他佐剂联合对疫苗免疫反应的影响 ,CpG基序以 1个TpC的 5′端开始 ,紧接着 3个GTCGTT基序 ,基序与基序之间由TpT或T分隔 ,在兔、小鼠和猪都能诱导机体产生强烈的免疫反应特别是细胞免疫反应。

负载GST抗原的树突状细胞疫苗联合CpG ODN抗日本血吸虫感染的保护性研究

目的研究负载GST抗原的树突状细胞(DC)疫苗联合非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpGODN)免疫小鼠抗日本血吸虫感染的作用。方法将GST抗原纯化后负载树突状细胞株DC2.4,免疫荧光染色法检测GST的负载情况,并进行动物保护性实验。35只C57BL/6小鼠随机均分7组(每组5只),分别作免疫注射:A组为未处理的DC,B组为牛血清白蛋白(BSA)处理的DC,C组为GST负载的DC,D组为GST+CpGODN共刺激的DC,E组为CpGODN刺激的DC,F组为GST蛋白,G组为空白对照组。A～E各组DC经0.25%胰蛋白酶消化后用PBS调整密度至107/ml,每鼠皮下注射0.1ml,每次间隔2周,共免疫3次。F组首次每鼠免疫50μgGST蛋白加福氏完全佐剂,第2、3次分别免疫50μg、10μgGST蛋白加福氏不完全佐剂,均为皮下注射。各组于末次免疫后10d收集血清,ELISA方法分析血清中的特异性抗体。各组小鼠于末次免疫后2周每鼠经腹部感染尾蚴30±1条。6周后剖杀小鼠,计算减虫率。结果 DC经GST负载后可在荧光显微镜下观察到抗GST的特异荧光,表明抗原已被DC摄取。各组小鼠免疫后,F组抗体水平最高,为2.1270±0.4115,另外C组(0.5552±0.0789)和D组(0.7150±0.0523)的抗体水平均高于G组(0.2358±0.0889),差异有统计学意义(P<0.05)。免疫后攻击感染,D组小鼠的减虫率最高为53.3%,其次为F组(24.0%)和C组(21.3%),但D组与两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CpGODN联合GST抗原负载的树突状细胞疫苗具有一定的抗日本血吸虫感染作用。

CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的抑制作用

目的明确抑制性CpG ODN 208(CpG-N ODN)对刺激性CpG ODN 1826(CpG-S ODN)诱导单核/巨噬细胞分泌TNF-α的影响,为通过拮抗细菌DNA达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法选用本室前期筛选出的对CpG-S ODN活化RAW 264.7细胞有抑制作用的CpG-N ODN,观察其对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的影响;应用流式细胞术观察CpG-NODN对CpG-S ODN与hPBMC表面结合和内化的影响。结果浓度比为1∶1的CpG-N ODN对刺激性CpG-S ODN诱导hPBMC分泌TNF-α具有抑制作用,并呈一定时效关系;CpG-N ODN对CpG-S ODN在hPBMC细胞表面的结合和内化具有抑制作用。结论CpG-N ODN对CpG-S ODN活化hPBMC具有抑制作用,这个作用可能与其影响hPBMC的表面结合和内化CpG-S ODN有关。

自然养殖水体投喂CpG ODN和表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗WSSV的免疫保护作用

用添加CpG寡聚核苷酸(CpG ODN)和表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母(VP28-yl)的饵料投喂凡纳滨对虾,进行田间中试实验。投喂30 d后进行WSSV感染实验,评估其对凡纳滨对虾的免疫保护作用。投喂实验结束后,CpG ODN投喂组对虾的相对增重率达到(65.8±7.8)%(P<0.05),这暗示CpG ODN可能具有促生长作用。WSSV攻毒后,CpG ODN和VP28-yl投喂组对虾中WSSV拷贝数与对照组相比均显著降低(P<0.05),相对免疫保护率分别可达到26.7%和36.7%。在投喂结束和WSSV刺激后,CpG ODN组对虾中的呼吸爆发水平均显著升高(P<0.05)。而在VP28-yl投喂组,WSSV引起的细胞凋亡则显著受到抑制(P<0.05)。此外,WSSV刺激后,STAT基因在CpG ODN组和VP28-yl组对虾中的表达水平均显著上调(P<0.05),分别在第5天和第3天达到最大值,而对照组中则显著下调。研究结果表明,CpG ODN和VP28-yl增强了凡纳滨对虾抗病毒免疫力,对养殖对虾病毒性疫病的防控具有显著作用,可以作为免疫增强剂添加在饵料中,具有在养殖生产中推广使用的前景。

不同CpG ODN对大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的研究

目的:筛选对大鼠骨髓间充质干细胞增殖具有影响作用的CpG ODN。方法:体外全骨髓贴壁法提取并纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代孵育12 h至完全贴壁,双盲法加入不同CpG ODN共孵育48 h,MTT比色法检测,不同大鼠重复实验3次,筛选促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的CpG ODN。结果:与PBS溶媒对照组相比,有4条CpG ODN对不同大鼠BMSCs均具有显著促增殖作用,MTT结果具有统计学意义(P<0.05)。结论:4条CpG ODN具有显著促进大鼠BMSCs增殖的作用,将在下一步的实验中探讨它们对BMSCs分化功能的作用。

CpG ODN对非小细胞肺癌患者化疗后免疫功能的影响

目的测定非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者化疗前后外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)经胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(cytosine-phosphorothioateguanine oligodeoxynucleotides,CpG ODN)刺激后,CD4+CD25highTreg细胞及IFN-γI、L-12的变化,评价不同时间点CpG ODN的干预效果。方法选取NSCLC患者20例,分别抽取患者化疗前(d0)、化疗后第3天(d3)及第7天(d7)外周血3 mL,分离PBMC。每份PBMC均分为实验组及对照组,实验组给予CpG ODN 2006刺激,对照组不做干预。经培养48 h后收集细胞以流式细胞仪检测CD4+CD25highTreg细胞百分比,并取上清液检测INF-γ和IL-12(pg/mL)。结果实验组CD4+CD25highTreg细胞百分比在d0、d3、d7分别为(2.22±0.66)%,(2.09±0.44)%和(2.08±0.48)%,较对照组均有明显下降(P<0.05)。实验组IFN-γ在d0、d3、d7分别为(40.64±5.90)、(40.57±5.80)和(45.30±4.78)pg/mL,d0和d7时较对照组显著增加(P<0.05),d3时变化不明显(P>0.05)。实验组IL-12在d0、d3、d7分别为(41.02±6.65)、(39.41±7.41)和(45.75±12.46)pg/mL,d0和d3时较对照组明显增加(P<0.05),而d7时变化不明显(P>0.05)。动态观察对照组,d3时CD4+CD25highTreg细胞比例下降至最低点,而后逐渐回升;实验组在d7时CD4+CD25highTreg细胞比例仍持续下降;实验组的IFN-γ值呈现升高趋势,d7和d0、d3相比明显升高(P<0.05);而实验组IL-12值在化疗前后无明显变化,即化疗前d0与化疗后d3、d7比较,以及d3与d7比较,差异均不明显(P值均>0.05)。肺癌患者化疗次数及外周血淋巴细胞的数目与CpG ODN对CD4+CD25highTreg细胞比例及IFN-γI、L-12的分泌作用无显著相关性(P>0.05)。结论 CpG ODN能有效下调CD4+CD25highTreg细胞,刺激INF-γ的分泌,优化肺癌患者抗肿瘤的免疫微环境,有利于机体的抗肿瘤免疫;肺癌患者即使化疗后外周血淋巴细胞的数目明显减少,CpG ODN仍能下调CD4+CD25highTreg细胞和刺激INF-r的分泌,发挥抗肿瘤作用。

鸭特异性CpG ODN体外抑制鸭坦布苏病毒复制的研究

为明确鸭特异性寡聚脱氧核苷酸(Cp G ODN)体外对鸭坦布苏病毒(DTMUV)复制的抑制作用,研究在Cp G ODN最佳活性分子筛选的基础上,与DTMUV感染后的细胞进行共孵育,分别采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法(MTT法)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测不同浓度Cp G ODN-D2对DTMUV复制的抑制作用。结果显示:对非洲绿猴肾(Vero)细胞来说,Cp G ODN-D2浓度在300μg/m L以内均为安全浓度;MTT法和q RT-PCR检测结果均表明,各浓度Cp G ODN-D2对DTMUV的复制均有一定的抑制作用,并随浓度升高呈现先上升后下降的趋势,其中30μg/m L的浓度效果最佳,达到84.74%。结果证实了Cp G ODN-D2作为新型免疫调节剂可有效抑制DTMUV的复制。

多聚胺胆固醇阳离子脂质体介导CpGODN雾化吸入对哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞的影响

目的探讨雾化吸入多聚胺胆固醇阳离子脂质体(PCL)与CpGODN复合物(CpGODN/PCL复合物)对哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞(EOS)的影响。方法采用卵蛋白激发法建立哮喘小鼠模型,并设置正常对照组、哮喘对照组、CpGODN/PCL干预组、CpGODN干预组,每组6只。在雾化PCL介导转染CpGODN 48h后,分离小鼠左肺组织,切片HE染色,显微镜下检测EOS浸润情况,同时检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞浸润情况。结果用卵蛋白激发法成功地制备了哮喘小鼠模型。哮喘对照组肺组织肺泡腔黏液分泌增加,支气管及血管周围大量炎性细胞浸润,以EOS、淋巴细胞为主,与正常对照组比较,BALF中细胞总数、EOS数目和百分率均明显增加(P<0.01)。而与哮喘对照组比较,CpGODN干预组细胞总数,EOS数目和百分率显著下降(P<0.01)。CpGODN/PCL干预组与CpGODN干预组比较,细胞总数无统计学差异,EOS数目、百分率的差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论哮喘小鼠肺组织EOS浸润和气道黏液分泌,雾化介导CpGODN干预哮喘小鼠模型可减轻以EOS为特征的炎症反应,利用PCL为转染载体包裹CpGODN,可提高转染效率。

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的 Cp G ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗 HBs的影响 .方法 构建编码乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原蛋白 S的重组真核表达质粒p CR3.1- S作为 HBV基因疫苗 ,人工合成含 Cp G motif的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂 ,以 BAL B/ c小鼠作为实验动物进行免疫接种 ,采用 EL ISA法检测免疫小鼠的抗 HBs应答 .结果 与生理盐水作为佐剂组相比较 ,应用 Cp G ODN组小鼠产生更强的抗 HBs反应 (P<0 .0 5 ) .结论 Cp G ODN作为佐剂可促进 HBV基因疫苗诱导 BAL B/ c小鼠产生抗 HBs应答 .

包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂质体疫苗的免疫效果

非磷脂脂质体NovasomeR○(Np )是由Brij5 2、胆固醇和油酸组成 ,可作为同时传递佐剂和抗原的载体。我们将HBsAg与天然骨架CpGODN (phosphodiesterCpGODN ,pdCpGODN )包裹于Np后免疫BALB/c小鼠 ,检测其免疫效果。结果显示 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np在小鼠中诱导了很高滴度的抗 HBs抗体产生并诱生了HBsAgS2 8 3 9特异性的CTL ,而铝佐剂组和仅包裹HBsAg的Np组诱生的抗体滴度较低 ,未检测到CTL活力。抗体亚类分析结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np诱生的免疫应答类型与pdCpGODN剂量有关 ,较低剂量 (2 4 μgpdCpGODN )诱生的为IgG2a为主的Th1型应答 ,而较高剂量(4 7μgpdCpGODN )诱生的是Th1/Th2混合型应答。铝佐剂和仅包裹HBsAg的Np组诱生的是以IgG1为主的Th2型应答。此外 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np免疫小鼠脾淋巴细胞在体外HBsAg刺激培养后特异性增殖并分泌高水平的IFN γ。这些结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np能增强HBsAg的免疫原性 ,诱生体液 /细胞免疫均衡应答 。

CpGODN对哮喘小鼠肺组织GITR/GITRL表达的影响

目的观察CpGODN干预对哮喘小鼠肺组织GITR及GITRL表达的影响。方法 48只SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照组(简称对照组),哮喘模型组(简称模型组),地塞米松治疗组,CpGODN治疗组。以卵清白蛋白(OVA)致敏和激发建立小鼠哮喘模型。观察肺组织病理;对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类及计数;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化检测肺组织中GITR、GITRL的表达。结果 BALF中嗜酸性粒细胞平均(x±s,下同)计数:CpGODN组为(2.76±0.25)×107/L,地塞米松组为(1.05±1.72)×107/L,均低于模型组的(12.09±2.62)×107/L,差异有统计学意义(P<0.01),CpGODN组与地塞米松组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR、免疫组化结果:CpGODN组与地塞米松组GITR、GITRL表达高于模型组,差异有统计学意义(P均<0.05),CpGODN组GITRL mRNA、GITR蛋白表达高于地塞米松组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析:肺组织GITR与GITRL表达呈正相关(P<0.01,n=40)。结论 CpGODN能改善哮喘小鼠气道炎症,显著增强哮喘小鼠模型中GITR及GITRL在肺组织中的表达。

TLR9在胃癌细胞上的表达及其作用的实验研究

目的探讨TLR9在胃癌细胞MGC803上的表达及其激动剂对MGC803细胞增殖和凋亡的影响。方法用RT-PCR方法检测MGC803细胞上TLR9的表达;用TLR9的激动剂CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodexy-nucleotides,CpG-ODN)10μg.mL-1分别作用MGC803细胞24、48 h和72 h后,用MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术观察CpG ODN作用MGC803细胞24 h后的细胞凋亡现象。结果 MGC803细胞上有TLR9的表达;TLR 9激动剂CpG ODN作用于MGC803细胞不同时间点,均能明显抑制MGC803细胞生长(P<0.01),以早期凋亡为主。结论 TLR9激动剂CpG ODN对胃癌细胞的生长具有抑制作用。

含CpG寡脱氧核苷酸增强人肺癌细胞株A549放射敏感性的研究

目的探讨含CpG基序的寡脱氧核苷酸对人肺癌细胞株A549放射敏感性的影响。方法分别用不同浓度CpG ODN处理A549细胞,经β射线照射后,检测细胞增殖和集落形成情况,ELISA法检测细胞TNF-α、IL-12和INF-γ的分泌水平,G riess检测细胞NO的含量。结果 CpG ODN抑制A549细胞的增殖,并呈量效关系。CpG ODN(10μg/m l)联合β射线照射,抑制A549细胞的增殖作用最强,且增加了TNF-α、IL-12、INF-γ和NO的分泌。结论 CpG ODN对A549细胞有明显的放射增敏作用,其机制可能与CpG ODN抑制A549细胞增殖、增强TNF-α、IL-12、INF-γ和NO的分泌有关。

CpG ODN增强人外周血单个核细胞对肝癌细胞系HepG-2杀伤活性的实验研究

目的探讨CpG ODN在体外对人外周血单个核细胞的活性和肿瘤杀伤作用的影响。方法用CpG ODN刺激在体外分离培养的人外周血单个核细胞,检测其活性和对肝癌细胞系HepG-2杀伤作用。结果CpG ODN组PBMC培养上清IFN-γ显著高于对照组(P<0.05)。经CpG ODN刺激72小时后与HepG2细胞作用,48小时后乳酸脱氢酶在培养液中活力较对照组增强,差别具有显著性(P<0.05)。结论CpG ODN可明显提高人外周血淋单个核细胞对肿瘤的杀伤活性。

CpG ODN对急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠免疫治疗作用研究

目的:探讨两种CpG ODN序列对急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠模型的免疫治疗作用。方法:通过注射WEHI-3细胞构建急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠模型,分别皮下注射PBS无菌缓冲液、CpG 1826、CpG Seq14,观察治疗后各组小鼠的一般状况、生存时间、瘤结节生长、病理切片等,综合评价两种CpG ODN的治疗效果。结果:皮下接种1×10~6个WEHI-3细胞,成功建立急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠模型。肿瘤组平均生存时间20.87天,CpG 1826组32.60天,CpG Seq14组28.35天,两种CpG治疗组小鼠平均存活时间明显较肿瘤组长,P<0.05;实验初期,肿瘤组及两CpG治疗组小鼠较正常组小鼠体重增长明显,终末期体重明显下降;肿瘤组小鼠瘤结节较同期两CpG治疗组小鼠大,且增长速度快;肿瘤组小鼠肝脏、脾脏、肿瘤组织中均可见广泛瘤细胞浸润,CpG治疗组肝脏、脾脏中瘤细胞浸润明显减少,脾脏白髓区明显较对照组扩大,小鼠免疫功能增强,减少了肿瘤细胞的器官浸润;两实验组小鼠注射CpG部位均未见红肿、硬结、坏死等不良反应。结论:CpG 1826、CpG Seq14直接用于急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠模型的免疫治疗,均可增强小鼠抗肿瘤作用,延长生存时间,且无明显毒副作用。

CpG ODN诱导人PBMC对结肠癌细胞体外杀伤作用的研究

目的以CpG ODN为免疫佐剂激活人外周血单个核细胞(PBMC),观察激活的PBMC对肿瘤细胞的杀伤活性。方法分别以肿瘤抗原(Ag)、白细胞介素-2(IL-2)和CpG ODN单独或联合刺激正常人和肿瘤患者PBMC,测定其对肿瘤细胞的杀伤活性。结果以CpG ODN刺激人PBMC组的细胞,其对肿瘤细胞的杀伤活性明显高于对照组(P<0.05)。结论 CpG ODNI、L-2与肿瘤抗原共同刺激能有效提高人PBMC的杀伤活性。

人乳腺癌疫苗HSP65-HER2联用CpG684的抗肿瘤作用

目的:检测人乳腺癌融合蛋白疫苗HSP65-HER2联用CpG684的抗肿瘤效果。方法:C57BL/6小鼠分别皮下注射PBS,CpG684,HSP65-HER2和CpG684混合物,一周一次,共三次,随后给小鼠腹腔接种7.5×104个转染了pcDNA3-GFP-HER2质粒的B16肿瘤细胞(HER2+B16),监测各组小鼠的生存期至接种肿瘤后70天。结果:免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠在接种肿瘤后70天时,仍有80%存活,而GpG684组的小鼠仅有10%存活,PBS组小鼠在接种肿瘤后36天后全部死亡。与PBS和CpG684对照组相比,免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠的生存期显著延长(P<0.01)。结论:HSP65-HER2联用CpG684在体内发挥了强大的抗肿瘤活性,为进一步的临床研究和应用奠定了基础。