番木瓜WRKY转录因子CpWRKY11的克隆和表达

【目的】克隆番木瓜炭疽菌诱导的WRKY转录因子CpWRKY11,研究其在生物胁迫、外源激素处理及非生物胁迫条件下的表达特征,为CpWRKY11基因在后续番木瓜分子育种中的应用提供理论支持。【方法】从自主选育的炭疽病抗性品种中克隆WRKY转录因子CpWRKY11,采用SMART、ExPaSy、NetPhos和DNAMAN软件对该基因及其编码的蛋白序列进行生物信息学分析,利用MEGA-X软件进行系统进化树构建和分析;构建亚细胞定位载体CpWRKY11-GFP,通过转化水稻原生质体,确定CpWRKY11的亚细胞定位情况;利用酵母单杂交试验验证CpWRKY11是否具有转录激活活性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析CpWRKY11在番木瓜不同组织(根、茎、叶、花和果实)及生物胁迫(短孢炭疽菌和番木瓜畸形花叶病毒侵染)、外源激素(水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ETH))和非生物胁迫(高盐、干旱和机械损伤)处理下的表达情况。【结果】CpWRKY11基因编码序列全长1719 bp,编码572个氨基酸;CpWRKY11含有60个磷酸化位点,理论分子量为62.31 ku,理论等电点为6.75,不稳定指数为51.17,亲水性为-0.792,是一个亲水不稳定蛋白。CpWRKY11有2个典型的WRKY结构域,同源氨基酸比对及进化树分析结果显示,CpWRKY11与拟南芥AtWRKY20的同源性最高,属于WRKY家族Ⅰ类。亚细胞定位结果显示,CpWRKY11只定位在细胞核上。酵母转录激活验证试验结果显示,CpWRKY11蛋白不具有转录激活活性。CpWRKY11在番木瓜中为组成型表达,在茎中表达量最高,其次为根、果实和花,在叶中的表达量最低。CpWRKY11受短孢炭疽菌和PLDMV的诱导上调表达,在短孢炭疽菌诱导48 h内持续上调,与0 h对照相比其表达量均显著上调,且在反应后期(24和48 h)表达量更高。在PLDMV处理条件下,除接种第3天外,CpWRKY11也均呈现出明显的上调趋势。外源激素处理结果显示,CpWRKY11受SA、ETH和MeJA的诱导上调表达,尤其是在MeJA处理下,CpWRKY11被强烈诱导而显著上调表达,处理48 h内的表达量较对照上调1.9倍以上。CpWRKY11受机械损伤的强烈诱导,表达量显著上调。【结论】CpWRKY11是调控番木瓜逆境胁迫响应,尤其是病原菌侵染及机械损伤响应的重要因子。CpWRKY11可能主要通过JA信号途径参与病原菌应答反应,是具有潜在利用价值的重要候选基因。