美洲大蠊主要变应原Cr-PI基因同源性分析

目的 探索研制美洲大蠊重组变应原疫苗的新途径 ,对美洲大蠊主要变应原Cr PI基因序列进行同源性分析。方法 选用从本室构建的美洲大蠊若虫cDNA文库中筛选到的 5个阳性克隆 ,在测序的基础上 ,通过互联网进入NCBI主页 ,采用Blastn程序 ,将测得的美洲大蠊主要变应原基因序列与GenBank中的基因序列进行同源性分析。结果 所筛选到的美洲大蠊若虫 5个新基因中 ,一个为核糖体蛋白基因 (AF 31 4 962 ) ,一个为美洲大蠊主要变应原Cr PI基因 (AF31 4 963) ,且中国大陆美洲大蠊主要变应原Cr PI基因序列与不同地理分布的美洲大蠊Cr PI基因序列有一定差异。结论 不同地理区域的美洲大蠊同一种变应原其基因序列有一定差异 ,编码的氨基酸亦不相同。本研究提示在临床变态反应疾病的诊断和脱敏治疗中 ,为了提高其诊断的特异性和治疗疗效 ,应尽可能使用具有我国区域特色 (即本地化 )

蟑螂变应原Cr-PI包涵体的变复性研究

本研究优化了GST CrPI融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件和GST CrPI包涵体的复性条件 ;采用GlutathioneSepharoseTM 4B亲和层析分离纯化融合蛋白 ,以Xa酶切去掉其GST标签后 ,对CrPI进行了电喷雾电离串联质谱分析 (ESI MS MS)。结果表明 ,IPTG浓度对该蛋白的诱导效果影响不大 ,OD6 0 0 值为 0 6时诱导效果最佳 ;复性蛋白浓度和L 精氨酸浓度对稀释复性结果有重要影响。纯化融合蛋白经Xa酶切、分子筛层析去掉GST标签后 ,重组蛋白的纯度达 95 % 。

美洲大蠊变应原CrPI的表达、纯化与免疫学特性鉴定

以阳性噬菌体克隆为模板 ,通过PCR扩增出目的基因片段并克隆入T载体 ,经测序证实为美洲大蠊Periplanetaamericana变应原CrPI后 ,将该基因亚克隆入表达载体pGEX 5X 1。美洲大蠊变应原CrPI在大肠杆菌中得到高效表达 ,但主要以包涵体形式存在于沉淀中。目的蛋白溶于 6mol L盐酸胍并经稀释复性后 ,经GlutathioneSepharoseTM 4B亲和层析 ,纯度达 90 %以上。以蟑螂过敏病人血清进行免疫印迹检测 ,结果显示重组变应原具有良好的IgE结合活性。