基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法的Ddx3x肝脏条件性敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁(DEAD-box RNA helicase 3X-linked,Ddx3x)肝脏条件性敲除小鼠。方法设计特异的sgRNA序列,在Ddx3x基因外显子4~10两端插入LoxP序列,构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法对F0代和F1代小鼠进行基因鉴定。将Ddx3x-flox F1代小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏条件性敲除Ddx3x基因小鼠(Ddx3x^(Δhep))。采用PCR方法和Western blotting方法分别检测Ddx3x^(Δhep)基因小鼠目的基因与蛋白的表达。选取8周龄雄性野生型C57/6J小鼠、Ddx3x^(Δhep)小鼠、Ddx3x^(fl/fl)小鼠,测定血清ALT、AST水平评价肝脏肝损伤情况。结果对F1代小鼠基因PCR鉴定的结果表明,基因型符合Ddx3x^(fl/fl);F1代小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代与Ddx3x^(fl/fl)小鼠杂交,即获得Ddx3x^(Δhep)小鼠;PCR与Western blotting结果显示,目的小鼠肝组织中Ddx3x基因和蛋白表达显著降低。此外,Ddx3x^(Δhep)小鼠无胚胎致死现象,出生后生理状况良好。正常饲养条件下,Ddx3x^(Δhep)小鼠与Ddx3x^(fl/fl)小鼠及野生型小鼠相比,血清ALT、AST指标及体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法成功构建了Ddx3x^(Δhep)小鼠动物模型,为后续研究Ddx3x在肝脏中的生物学功能及作用机制奠定了良好的基础。

采用Cre-loxP技术构建肝脏特异性Trappc11基因敲除小鼠模型

目的采用Cre-loxP系统构建肝脏组织特异性Trappc11基因敲除小鼠(Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-))模型以探究脂肪肝的发病机制。方法用带有loxP位点的Trappc11纯合子小鼠(Trappc11^(flox/flox))和带有Alb-Cre的转基因小鼠(Alb-Cre^(+/-))进行杂交,对其子代进行基因型鉴定。筛选出Trappc11^(flox/+)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,将其与Trappc11^(flox/flox)小鼠进一步杂交可获得Trappc11肝脏特异性敲除鼠。将3~4周龄的Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-)、Trappc11^(flox/+)-Alb-^(Cre+/-)和Trappc11^(flox/flox)-Alb-^(Cre-/-)小鼠各3只,提取各组织脏器中的DNA,检测Trappc11的敲除效率和特异性。然后,在mRNA和蛋白质水平进一步验证。于第4周开始监测摄食量和体重等指标。结果我们成功繁育出肝脏特异性Trappc11基因敲除鼠,敲除心、脾、肺、肾、胰腺、肌肉、脂肪和脑组织中该基因表达未受影响,mRNA水平敲除效率达85%以上且TRAPPC11蛋白水平下降。该敲除鼠目前生长状态良好,饮食饮水正常,可用于后期繁殖与机制研究。结论已经构建成功的Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-)鼠将为探索Trappc11在肝脏中的生理病理作用提供在体模型。

Cre/loxP条件性基因敲除小鼠在椎间盘退变研究中的应用

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是一个在生命早期就开始的过程,其与遗传、机械负荷、创伤和营养因素以及衰老密切相关,已证是腰痛的主要原因之一[1]。然而,IDD的分子生物学机制仍然不清楚。椎间盘的不同细胞类型表达不同的基因,以调控椎间盘的发育和稳态。

基于Cre/Loxp系统的Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠的构建及效率检测

目的构建报告基因小鼠,评价Csf1r-Cre^(ERT2)介导增强黄色荧光素蛋白EYFP标记组织CD45^(+)细胞CSF1R的效率。方法Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠繁育,他莫昔芬诱导、PCR筛选Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)小鼠,流式细胞术和Western blot分析EYFP对不同组织以及不同组织CD45^(+)细胞中CSF1R的标记效率。结果获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠。此外,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP可有效标记小鼠组织CSF1R以及不同部位中CD45^(+)细胞。与R26R^(EYFP)组比较,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP标记效率最高的是脑组织(P<0.001),最低的是胸腺组织(P<0.05),脾脏组织则差异无统计学意义。结论成年Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠是获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)诱导型条件性荧光小鼠的有效途径。Csf1r-Cre^(ERT2)介导EYFP可对小鼠不同部位CSF1R以及CD45^(+)细胞中CSF1R进行有效示踪。

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

基于Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性突变NLRP3转基因小鼠模型

目的应用Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性NLRP3点突变转基因小鼠模型并对其进行鉴定。方法利用Cre-LoxP技术,构建NLRP3基因T346M点突变的flox杂合子(NLRP3^(flox)/+)小鼠。将该小鼠与广谱表达Cre重组酶工具鼠(CAG-Cre/ERT2,CreT)杂交繁育,获得基因型NLRP3^(flox)/+CreT^(+/-)小鼠,后者与NLRP3 T346M的flox纯合子(NLRP3^(flox)/flox)小鼠进一步交配获得NLRP3^(flox)/flox CreT^(+/-)(KI/KI)和NLRP3^(flox)/+CreT^(+/-)(KI/WT)小鼠,于6~8周时经他莫昔芬的诱导实现NLRP3 T346M突变基因的时间特异性敲入。小鼠繁育和鉴定过程中,用PCR方法检测鼠尾基因组DNA。采用Western blot法检测小鼠肝脏和心脏中NLRP3、pro-Caspase-1和Caspase-1的蛋白质表达水平。结果小鼠给予他莫昔芬后,NLRP3 T346M突变基因被诱导敲入。Western blot结果显示,KI/KI小鼠肝脏和心脏组织以及KI/WT小鼠心脏中NLRP3炎性小体效应蛋白Caspase-1的表达水平较同窝野生型小鼠显著上调。结论本研究基于Cre-LoxP技术成功构建了NLRP3 T346M突变转基因小鼠模型,该模型小鼠在他莫昔芬诱导后可出现自发性的NLRP3炎症小体活化,这为探究NLRP3炎症小体活化机制以及筛选和评价NLRP3炎症小体抑制剂提供了新的时间特异性的实验动物模型。

利用Cre-Loxp技术构建标记肝星状细胞的小鼠模型

目的通过Cre-Loxp技术构建转基因小鼠,应用Lrat^(Cre)工具鼠示踪肝星状细胞分布。方法将Lrat^(Cre)小鼠与H11^(LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)报告基因小鼠交配,通过PCR鉴定得Lrat^(Cre)H11^(LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)报告基因小鼠。固定小鼠肝脏切片,借助免疫荧光标记肝脏非实质细胞抗体,通过Imaris 3D还原分析肝星状细胞和其他肝脏非实质细胞间的表达与分布,以及进行肝星状细胞的自定位检验。结果Lrat^(Cre)介导的红色荧光蛋白tdTomato的表达可以特异性标记肝星状细胞,并通过肝星状细胞与肝脏巨噬细胞、肝窦内皮细胞的免疫荧光定位为细胞间相互作用分析提供了途径。结论Lrat^(Cre)可以介导tdTomato对肝星状细胞进行示踪,同时可用做肝星状细胞特异性的报告基因工具鼠。

基于Cre-LoxP系统的B细胞特异性荧光报告基因小鼠模型的构建及鉴定

目的应用Cre^(-)LoxP重组酶系统构建B细胞特异性表达tdTomato蛋白的荧光报告基因小鼠。方法在Gt(ROSA)26Sor(Rosa26)位点插入1个由CAG启动子驱动的报告基团,其LoxP侧翼设计有STOP盒,可阻止tdTomato荧光蛋白表达,经与CD19-Cre工具小鼠交配繁殖获得tdTomato^(CD19-Cre)小鼠,Cre重组酶特异性识别LoxP序列,删除STOP盒,从而使B细胞特异性表达tdTomato荧光蛋白。利用PCR进行基因型鉴定。通过流式细胞术和脑膜免疫荧光分别检测野生型对照组小鼠和tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脾和脑膜B细胞中tdTomato红色荧光蛋白表达。结果基因型为tdTomato^(F/-)CD19-Cre^(+)或tdTomatoF/FCD19-Cre^(+)的小鼠为B细胞特异性表达tdTomato天然红色荧光蛋白的荧光报告基因小鼠。而对照组小鼠基因型为tdTomato^(F/-)CD19-Cre^(-)或tdTomatoF/FCD19-Cre^(-)。流式细胞术测定结果表明,与野生型对照组小鼠相比,tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脾中表达tdTomato荧光蛋白的B细胞百分比均显著增加(P<0.01);在非B细胞群中仅检测到少量的tdTomato+细胞。且在滤泡型B细胞、边缘区B细胞、T1 B细胞、T2 B细胞和成熟B细胞等B细胞亚群细胞表面tdTomato荧光蛋白均能稳定表达(P<0.01),百分比分别为(88±8)%,(80±9)%,(86±9)%,(92±6)%和(89±7)%。通过与CD45共定位,在tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脑膜中也检测到tdTomato红色荧光蛋白表达。结论成功构建B细胞特异性表达tdTomato荧光蛋白的荧光报告基因小鼠模型,且tdTomato荧光蛋白可在外周免疫器官和中枢神经系统稳定表达。

CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果:成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;pALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建了VASN基因敲除的AML12细胞,为后续体外研究VASN在肝细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。

Cre/loxP系统应用于毕赤酵母基因敲除的研究进展

毕赤酵母是重组蛋白最常用的表达系统之一,蛋白高水平表达策略一直是领域内最重要的研究课题之一。在后基因组时代,高效而便捷的基因改造是一种有效提高毕赤酵母蛋白表达能力的手段,其中由Cre/loxP系统介导的基因改造技术受到了科研人员的广泛关注。综述了Cre/loxP系统的基本原理、应用于毕赤酵母基因敲除的技术路线及其关键的技术问题。

Wnt1-Cre和Pax2-Cre标记的小鼠第一鳃弓颅颌面部神经嵴细胞异质性研究

目的利用Wnt1-Cre和Pax2-Cre小鼠特异性标记颅颌面神经嵴细胞(CNCs)迁移到第一鳃弓时的分化异质性及机制。方法分别收取胚胎期(E)8.0~E9.25Wnt1-Cre;R26R^(mTmG)及Pax2-Cre;R26R^(mTmG)小鼠胚胎进行整体荧光观察,利用石蜡切片免疫荧光对E15.5的Pax2-Cre;R26R^(Ai9)和Wnt1-Cre;R26R^(Ai9)小鼠所标记的CNCs在颅面部主要组织器官中的谱系分化情况进行比较分析,最后对E10.5的Wnt1-Cre;R26R^(mTmG)和Pax2-Cre;R26R^(mTmG)小鼠的第一鳃弓组织中CNCs进行单细胞测序分析,并对差异基因进行荧光定量聚合酶链反应(q-PCR)验证。结果Pax2-Cre和Wnt1-Cre小鼠特异性标记的CNCs均在E8.0自神经板开始迁移,但Pax2-Cre小鼠仅标记迁移到第一鳃弓的CNCs,而Wnt1-Cre同时标记了迁移到第一和第二鳃弓的CNCs;在分化谱系示踪方面,二者皆标记了CNCs分化形成的颅颌面部组织器官的间充质,但Wnt1-Cre在上腭和舌中标记CNCs更多;在第一鳃弓间充质中,Pax2-Cre所标记的CNCs特异性表达基因主要参与了成骨,而Wnt1-Cre所标记的CNCs特异性表达基因主要参与了肢体发育、细胞迁移和成骨,q-PCR结果也证实了两者高表达差异基因参与了以上功能。结论本研究结果提示Pax2-Cre小鼠可特异性用于第一鳃弓CNCs及其衍生组织成骨方面的研究。

Vav^(Cre)介导的荧光报告系统对小鼠小胶质细胞的标记效率

目的:探讨Vav^(Cre)介导的荧光报告系统对小胶质细胞的标记效率。方法:将Vav^(Cre)/Rosa26REYFP fl/fl雄鼠与C57BL/6雌鼠杂交获得Vav^(Cre)/Rosa26REYFP^(fl/-)和Rosa26REYFP^(fl/-)子代。以发现雌鼠阴道栓的时间标记为E0.5,流式细胞术检测EYFP在E7.5~E8.25、E10~E10.5、E12~E12.5、E14~E14.5小鼠胚胎和新生小鼠小胶质细胞中的表达。结果:Vav^(Cre)/Rosa26REYFP^(fl/-)组E10~E10.5、E12~E12.5、E14~E14.5胚胎和新生小鼠小胶质细胞中EYFP阳性率高于Rosa26REYFP^(fl/-)组(P<0.001),且均>95.000%。Vav^(Cre)/Rosa26REYFP^(fl/-)E7.5~E8.25小鼠胚胎中EYFP阳性率为(0.059±0.009)%。结论:以Vav^(Cre)介导的荧光报告系统可以稳定、高效地标记小鼠小胶质细胞,可以用于动态监测小胶质细胞的发育。

因为小,而而错过它?CREEK朗泉4040A紧凑型解码合并式功放

这应该是英国CREEK(朗泉)有史以来体积最小的合并式功放,其摆放面积还不及一张A4纸,如果光看照片而不看实物的话,你想象不到它是如此之小。但就是这么小的一台合并式功放,却集合了多种功能。如果是老一代发烧友,一定对4040这组数字很熟悉。早期,CREEK就有这样一台合并式功放,它具有纤细的机身,黑色的面板,具有木纹的顶板和侧板,面板上还有为数不少的按键和旋钮,它就是CREEK在1982年推出的CAS4040合并式功放。

基于Cre/loxP重组系统的多基因载体构建及烟草转化研究

利用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCryIAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于植物表达载体pYL1305上,命名为pYL1305BBGR。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR和Southern blot检测发现,多基因已成功转入烟草基因组中;经半定量RT-PCR检测证实,4个基因均能正常表达。

应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因

研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA(+)/nptⅡ(-)/Cre(-)的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%～46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率(144.44%)也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。

Cre/loxP位点特异性重组系统在植物中应用的研究进展

Cre/loxP位点特异性重组系统自发现以来,在植物基因重组领域得到了广泛应用,已成为提高转基因植物安全性的有效方法。本文介绍了该系统的基本概况及其在转基因植物表达载体构建方面的应用,尤其是在基因删除、定点整合、多基因表达以及杂种优势利用等方面的应用做了重点阐述。

Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价

选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用的打靶载体ΔMSTN含有LoxP位点锚定的选择标记表达框(LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-LoxP).经电穿孔将该打靶载体导入猪肾PK15细胞,经G418筛选,获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系.将Cre重组酶表达载体pTurbo-Cre导入该细胞系,借助流式分选(FACS)、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段,证明Cre-LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应,EGFP水平的删除效率达到46.1%,DNA水平的删除效率则达到97%.本文的研究结果为消除选择标记的安全隐患提供了可靠的解决方案,为建立猪安全转基因技术提供了重要的科学依据.

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracisAP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.

Cre/loxP定位重组系统在植物雄不育和杂种优势中的利用研究

Cre loxP是来源于噬菌体P1的一种位点特异性重组系统。目前 ,它已广泛应用于基因功能鉴定 ,动植物及微生物基因组的修饰以及基因的表达和调控。雄性不育系在杂种优势的利用中具有重要意义。本实验是以Cre loxP系统调控细胞毒素基因barnase在植物雄性器官发育的特异时期在特异组织表达 ,从而达到控制植物育性的目的。1 在本实验中 ,通过PCR方法克隆了解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens的barnase基因 ,及其抑制因子barstar的DNA序列 ,同时 ,构建成功双元表达载体及基因枪转化载体 ,并已获得经分子检测呈阳性的小麦植株。2 osg6B是来源于水稻花药绒毡层的特异性的启动子 ,它在小孢子发育的四分体时期至单核花粉期在花药绒毡层中特异启动基因的表达 ,它具有较为严紧的时空特异性。以osg6B为启动子 ,构建了一组受控于Cre/loxP位点特异性重组系统的适用于基因枪法转化小麦的载体系统。其中 ,转不育基因(og6B barnase)小麦植株生长正常 ,但开花后 ,花粉量明显减少 ,自交不能得到正常种子。进行花粉活力检测发现 ,转基因小麦大部分花粉表现为败育。花粉离体萌发试验表明 ,转不育基因小麦的花粉离体萌发率极低 ,几近败育。说明以osg6B驱动barnase在小麦花药中的表达可以导致雄性不育。3

基于Cre/loxP系统的糖皮质激素受体基因条件性打靶嵌合鼠的获得

目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件。方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交筛选发生正确同源重组的ES细胞,囊胚注射法制备嵌合体并进行生殖系检测及纯化建系。结果:成功构建了针对GR基因第2外显子的诱导型目标载体,转染ES细胞获得了工程化的ES细胞,经囊胚注射获得了由工程化的ES细胞和体细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论:基于Cre/loxP系统的GR基因条件性打靶嵌合鼠的获得,为得到理想的诱导型GR基因剔除小鼠模型奠定了基础。