乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证PCR技术的探索

为提高实验室检测克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的能力,本文依据NIFDC-PT-384乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证作业指导书、GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》,探索传统生化方法和PCR技术相结合的检测克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的方法。结果表明,样品CODE12未检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌),样品CODE19检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌),结果均为满意。本实验室具备检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的能力,PCR技术很好地印证了传统生化实验的结果。

克罗诺杆菌检测方法研究进展

克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)是一类重要的食源性致病菌,其引起的奶粉安全事件和新生儿致病问题受到了社会的高度重视。随着对该菌研究的深入和现代分类技术的不断发展,克罗诺杆菌的分类经历了从种到属的变化。但是截至目前,克罗诺杆菌的污染源和致病机制仍不清楚,为了防止易感人群的大规模疾病暴发,对于该菌的检测和预防尤为重要。本文对克罗诺杆菌的生化检测和分子检测的发展历程及存在问题进行综述,以期为该菌的研究提供参考。

阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)分子检测方法研究进展

阪崎肠杆菌(现克罗诺杆菌属)是一种重要的食源性条件致病菌,因其能通过污染婴幼儿配方食品导致严重的新生儿脑膜炎、菌血症和小肠结肠炎等疾病,而受到广泛的关注。其分子生物学检测方法克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题。目前常用的分子生物学方法主要有普通PCR、实时荧光定量PCR、环介导恒温扩增、探针方法等。

部分茶饮料原辅料中优势菌-克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)的分离和鉴定

克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)是新兴的条件致病菌,主要通过污染的婴儿配方奶粉引起2岁以下婴幼儿严重疾病甚至死亡。在对茶饮料原辅料192份样品进行细菌总数测定和优势菌16S rDNA序列分析时,发现2批次绿茶和1批次果葡糖浆中优势菌疑似条件致病菌-克罗诺杆菌,而且其数量较高(4.0×102cfu/g^104cfu/g)。进而通过rpoB序列分析,将4个分离株鉴定为阪崎克罗诺杆菌Cronobacter sakazakii(原阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii)。结果表明在常见的食品原料-果葡糖浆和绿茶中存在克罗诺杆菌的污染,rpoB分型方法在对克罗诺杆菌属细菌的鉴定到种上表现出高度特异性,灵敏而准确。

食品工业中克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)的污染与控制

克罗诺杆菌是一种新兴的食源性致病菌,能对新生儿引起如脑膜炎、败血症及坏死性小肠结肠炎等疾病,并带来严重的神经系统后遗症,有较高的死亡率,因此受到国内外的广泛关注。该文对克罗诺杆菌的生理生化特点、污染来源、生物膜形成及其在食品工业的污染和控制等方面的研究进展进行概述。

食品中克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)双重PCR检测方法研究

根据克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)16S rRNA基因以及局部大分子合成(MMS)操纵子特异序列设计2对引物,经反应体系和条件优化,建立了双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,Cronobacter spp.菌株PCR扩增均可见2条特异性条带,而其他菌株PCR扩增均为阴性。纯菌检测双重PCR的灵敏度为6.3×103 CFU.mL-1,而相对应单重PCR的灵敏度分别为6.3×101 CFU.mL-1和6.3×103 CFU.mL-1;人工污染的食品样品(奶粉、牛奶、鸡肉)在经过24 h增菌后,检测限均可达100 CFU.mL-1或100 CFU.g-1。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的条件下,双重PCR的检测限没有受到影响。表明本试验建立的双重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能克服食品样品基质及杂菌的干扰,可应用于食品中Cronobacter spp.的检测。

食品中3M^TM克罗诺杆菌属分子检测系统评价研究

目的用不同来源的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)、非目的菌、人工染菌食品样品,考核评估3M^TM分子检测系统对克罗诺杆菌属的检出限、灵敏度、特异性和准确度,以及与国标法(GB 4789.40-2016)检验结果的一致性。方法用3M^TM分子检测系统(molecular detection system,MDS)对实验室保存的50株已确认克罗诺杆菌属、40株非目的菌株进行检测,确定该试剂盒的检出限、灵敏度和特异性;对240份人工污染不同浓度目的菌样品,用3M^TM MDS和国标法同时检验,分析方法的准确度和检验结果的一致性。结果3M^TM MDS对50株不同来源的克罗诺杆菌属的检测灵敏度为100%,平均检出限为1.79×10^3 CFU/mL;对40株非目的菌检测结果均为阴性,特异性为100%。用3M^TM MDS与国标方法对人工污染10^1、10^0、10^-1 CFU/100 g克罗诺杆菌属FC718的240份不同来源乳粉、糊精、乳清和乳糖样品进行检测,结果一致性均大于95%,方法准确度为97.5%。结论3M^TM MDS方法具有低检出限、高灵敏和特异性特点,在不同食品样品基质中,检验结果呈现良好的准确度,与国标方法检验结果具有高度一致性,是一项适合基层、企业推广的快速、可靠方法。

乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。

食品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果与分析

目的:通过参加中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织ACAS-PT1091食品中克罗诺杆菌属检测能力验证项目,提升实验室内部检测克罗诺杆菌属的时效性和准确性。方法:将国标法(GB 4789.40-2016)结合VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行检测,同时采用BAX system Q7病原微生物快速检测系统分别进行分析。结果:样品21-M262和21-N690均检出克罗诺杆菌属,21-N690样品中含有干扰菌大肠埃希氏菌,样品21-M262中含有干扰菌弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌,检测结果均满意。结论:两种检测方法结果一致,BAX System Q7病原微生物快速检测方法相比国标法更加便捷和灵敏,两种方法交互验证,效率更快、准确度更高。

食品污染克罗诺杆菌(阪崎肠杆菌)的分离及鉴定

【目的】对300份奶粉样品和50份非奶粉类食品中克罗诺杆菌的污染情况做定量检测,并对分离得到的克罗诺杆菌进行鉴定。【方法】通过分子方法和9管法对奶粉和其他食品中克罗诺杆菌的污染情况做定量检测;通过吲哚产生、丙二酸盐利用、卫矛醇、肌醇、松三糖和松二糖发酵产酸等六种生化试验对分离株进行鉴定;同时对分离株的16S rRNA基因序列进行同源性分析,通过N-J(Neighbour-Joining)法构建系统发育树。【结果】定量检测结果表明,350份样品中有23份样品分离出克罗诺杆菌,共分离到24株克罗诺杆菌,检出率为6.6%;23份受污染样品中有4个样品的克罗诺杆菌大于100 MPN/100g;24株克罗诺杆菌被鉴定到种或亚种,其中19株为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii);2株为丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus);2株为都柏林克罗诺杆菌奶粉亚种(C.dublinensis subsp.lactaridi);1株为莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。【结论】分子方法和9管法联用适合污染率低而定量检测要求高的克罗诺杆菌的奶粉调查;采用生化和分子生物学方法将24株分离株鉴定到种或亚种,其中阪崎克罗诺杆菌为优势种;奶粉中克罗诺杆菌的污染问题对婴幼儿安全存在隐患,应引起消费者和有关部门的重视。

阪崎肠杆菌分类与致病机制

作为一种重要的食源性致病菌,阪崎肠杆菌因能引起新生婴幼儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎而受到了政府和社会的高度重视。2008年,阪崎肠杆菌被提议重新另立为隶属于肠杆菌科的一个包含有5个新种的新属——Cronobacter gen.Nov.。新属的五个种之间毒力作用存在差异,外膜蛋白A在黏附和抗吞噬过程中发挥了重要作用,同时本属菌株的侵入力在宿主细胞间的紧密联系被破坏时显著提高,但是一些肠道益生菌能抑制该菌侵入。目前阪崎肠杆菌的致病研究还比较分散,没有形成系统性,详细的致病机制期待进一步阐明。

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因方法的建立

目的建立克罗诺杆菌的特异、灵敏的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank公布的克罗诺杆菌MMS基因高保守序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化反应体系,用25种其他常见致病菌评价反应体系的特异性,用克罗诺杆菌MMS基因重组质粒构建实时荧光定量PCR标准曲线,对重组质粒、纯菌和人工模拟污染样本进行灵敏度试验,并与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR比较,配对t检验分析两种方法对Ct值和荧光强度的差异。结果采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因仅需40 min,与25种非目标菌无交叉反应,仅对克罗诺杆菌有特异性扩增;所构建方法线性关系良好,相关系数r2=0.999,扩增效率为99.972%,对重组质粒、纯菌、人工模拟污染样品标本的灵敏度分别达10拷贝/反应、3.8和38 cfu/ml;与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR相比,TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR的Ct值更小、△Rn值更高,灵敏度和分辨率差异均有统计学意义(Ct:t=-14.406,P﹤0.01;△Rn:t=14.230,P﹤0.01)。结论本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR反应体系能够快速、特异、灵敏地检测克罗诺杆菌MMS基因,可用于婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的快速筛查和鉴定,具有较大的的应用价值和推广价值。

克洛诺菌属分离株16S rDNA序列分析

目的对2株克洛诺菌属(原阪崎肠杆菌)模式株和29株食品分离株的16SrDNA进行序列分析。方法对菌株的16SrDNA进行PCR扩增、测序,获得目的菌的16SrDNA序列并通过BioNumerics软件对其进行多重对比分析和系统发育学分析。结果除ATCC51329和ES014外,其他克洛诺菌属与ATCC29544的16SrDNA序列均属于同一基因群,而ATCC51329和ES014分别属于另外一个分支。从16SrDNA序列分析可知,除ES014不能确定外,其它克洛诺菌属分离株均可从基因水平上得到准确鉴定。结论从基因水平上对国内克洛诺菌属食品分离株进行鉴定,并研究了相关菌株之间的系统发育学关系。

一株恒河猴克罗诺杆菌(阪崎肠杆菌)的分离鉴定及序列分析

目的对恒河猴粪便中分离到的一株克罗诺杆菌进行鉴定,为实验恒河猴疾病检测、鉴别诊断和治疗提供参考依据。方法通过细菌培养特性、菌落形态观察及微生物鉴定系统(ID32 E)生化试验进行菌落鉴定;并进行抗生素敏感试验和小白鼠致病性试验;用PCR方法扩增分离菌株的23S rRNA基因并测序,并将其与GenBank上参考菌株23S rRNA基因核苷酸序列进行同源性分析。结果经细菌形态学和生化鉴定该细菌为克罗诺杆菌,23S rRNA基因序列与GenBank中分离自婴幼儿配方奶粉中的阪崎克罗诺杆菌(CP004091)同源性为98%。药敏试验表明该菌对甲硝哒唑耐药,对其他15种抗生素敏感。致病性试验证明该分离菌株对小白鼠有强致病性。结论该株从恒河猴中分离到的克罗诺杆菌具有较强的致病性,对实验恒河猴饲养及相关研究人员有潜在的危害,因此,在恒河猴饲养及研究过程中应引起重视。头孢、庆大霉素和诺氟沙星等药物可作为治疗恒河猴克罗诺杆菌感染的临床用药。

乳粉中克罗诺杆菌属阪崎肠杆菌能力验证样品制备及应用

目的制备均匀性及稳定性均满足要求的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证样品,用于组织能力验证考核。方法通过生化及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法鉴定背景菌株及所使用的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)菌株。采用冷冻干燥技术制备均匀性及稳定性均满足要求且各种菌含量为10^(4)CFU/瓶的能力验证菌球。依据CNAS-GL003∶2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,随机抽取阳性样品和阴性样品各20份进行均匀性检验,再将样品存放于-20℃、4℃进行保藏稳定性检验,存放于25℃、37℃进行运输稳定性检验。依据GB 4789.40—2016制定作业指导书并发放样品,回收各实验室结果进行统计。结果目的菌株及背景菌株的鉴定结果均正确,均匀性、运输稳定性及保藏稳定性检验均符合能力验证样品的要求。依据评价原则及25家实验室反馈的结果,2021年度考核结果满意率为100%。结论乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证样品满足本年度能力验证的要求,为参加考核的检测机构提供了外部质控考核结果。

河南省9类食品中克罗诺杆菌属的污染检测

目的了解河南省流通环节食品中克罗诺杆菌属的污染状况,确定高危食品种类,为河南省流通环节的食品安全监管提供有效的科学依据,降低或避免对人民健康的危害。方法依照GB 4789.40-2016《食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》进行实验室检测。结果1497份样品中共检出克罗诺杆菌属阪崎肠杆菌27株,总检出率为1.80%。方便食品的污染情况最严重,检出率高达14.60%,其中芝麻糊受克罗诺杆菌属污染最严重,检出率高达50.00%;其次为藕粉,检出率为10.00%;麦片和其他谷物制品检出率较低,分别为9.46%和4.35%。婴幼儿辅助食品检出率为4.35%,其中婴幼儿面条受克罗诺杆菌属污染最严重,检出率为15.38%,婴幼儿米粉未检出克罗诺杆菌属。糖果制品、饮料和保健食品检出率较低,分别为0.50%、0.74%和0.62%,乳制品、膨化和薯类制品、肉类和糕点未检出。结论9类食品中检出克罗诺杆菌属有5类,应引起食品安全监管部门重视。

克罗诺杆菌属显色培养基的研究

目的为提高克罗诺杆菌属检出率,本实验室经过研究显色培养基的作用机理,优化研制出克罗诺杆菌属显色培养基(SWM)的配方,并与DFI琼脂、科玛嘉和国内某品牌的同类产品进行性能比较。方法通过GB 4789.28—2013对几种显色培养基的特异性和灵敏度进行比较,以及对人工污染样品和实际样品的检测差异进行分析。结果克罗诺杆菌属在SWM呈现特有的颜色,特异性强,可避免假阳性菌的干扰。在SWM上克罗诺杆菌属生长良好,生长率达到0.97,人工污染样品检测中能容易区分目标菌和其他杂菌,且可达到10 cfu的检出限。结论经过配方优化后的SWM对目标菌检测灵敏度更高,特异性更强,更易观察,综合检测效果可达到进口科玛嘉同类产品水平,避免了变形杆菌假阳性的缺点,可满足检测要求。