基于响应面法结合熵权法多指标优选巴豆霜炮制工艺研究

目的:利用多指标研究技术优化巴豆霜炮制工艺。方法:以巴豆霜中的有效成分巴豆苷和木兰花碱的含量作为评价指标,运用响应面法结合熵权法,考察不同烘制温度、不同烘制时间及不同压制时间对巴豆制霜炮制工艺的影响。结果:在162.8℃下烘制12 min后以20 kg压力板压制11.5天,测得巴豆霜生物碱含量综合评分为98.25%。结论:基于响应面法结合熵权法的多指标评价方法可靠,为巴豆霜的质量评价标准和巴豆相关制剂的质量研究提供了依据。

巴豆生物碱对肺腺癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的研究巴豆生物碱(CA)对肺腺癌细胞(A549)增殖和凋亡的影响,推测其抗肺癌作用机制。方法体外培养肺腺癌细胞(A549)。用终浓度分别为0(对照组)、10、50、100μg/mL的CA组处理A549细胞24 h后,于相差显微镜下观察细胞的一般形态结构、脱落情况等;MTT法检测细胞的生长活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率;酶联免疫法(ELISA)和RT-PCR法检测凋亡相关蛋白及基因Bcl-2、Bax的表达。结果 10、50、100μg/mL的CA均能抑制A549细胞增殖,其抑制率与作用剂量相关。流式细胞术检测显示不同剂量CA作用于A549细胞24 h后,100μg/mL的CA可引起细胞凋亡,其余剂量未见凋亡;100μg/mL的CA组细胞凋亡率为(45.940±0.031)%,对照组细胞凋亡率为(3.450±0.012)%,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA提示不同剂量CA作用于A549细胞24 h后,100μg/mL的CA组促凋亡蛋白Bax为8.940±0.211,较对照组(4.450±0.131)表达增加;抑凋亡蛋白Bcl-2为4.860±0.132,较对照组(7.390±0.181)表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR显示100μg/mL的CA组Bax mRNA为6.881±0.611,较对照组(3.417±0.461)表达增加;Bcl-2 mRNA为2.812±0.342,较对照组(4.243±0.731)表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CA能抑制A549细胞的生长并促进其凋亡,其发生与Bax蛋白及基因的表达上调和Bcl-2蛋白及基因的表达下调有关。CA抗肺癌的作用机制可能通过Bax/Bcl-2途径促进肿瘤细胞凋亡,从而为临床治疗肺癌提供新的思路和途径。

巴豆生物碱抑制卵巢癌细胞增殖和诱导其凋亡的实验研究

目的了解巴豆生物碱诱导人卵巢癌细胞HO-8910细胞周期、凋亡效果,以及凋亡与增殖细胞核抗原(PCNA)表达之间的关系。方法将浓度分别为50、100和150μg/ml的巴豆生物碱作用于人卵巢癌细胞HO-8910细胞后,采用流式细胞术检测巴豆生物碱对人卵巢癌细胞HO-8910细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡;采用倒置显微镜及免疫组织化学法对凋亡调节基因PCNA表达进行检测。结果巴豆生物碱作用48h后,倒置显微镜下可见细胞皱缩、出芽及少量凋亡小体形成。应用不同剂量的巴豆生物碱(50～150μg/ml)分别作用于HO-8910细胞24、48、72h后,巴豆生物碱抑制了HO-8910细胞增殖,并呈现剂量、时间依赖性。随着巴豆生物碱的作用时间延长,G0/G1期细胞比例明显下降,而较多的细胞阻滞于G2/M期。巴豆生物碱的作用浓度从50μg/ml增至150μg/ml,则平均细胞凋亡率从2.13%上升为21.89%。结论巴豆生物碱可以通过时间依赖性和剂量依赖性方式,促使细胞G2/M期阻滞和抑制细胞有丝分裂,从而诱导人卵巢癌细胞HO-8910细胞凋亡。由于PCNA在G1～S期进程过度中起着重要作用,PCNA表达的下调也导致细胞周期进程被阻抑。巴豆生物碱作用24h,随浓度的升高,PCNA阳性细胞百分率逐渐降低。

酸性染料比色法测定巴豆中总生物碱的含量

目的建立巴豆中总生物碱含量的测定方法,对不同产地的巴豆总生物碱质量分数进行比较研究。方法以木兰花碱作为对照品,采用酸性染料比色法测定巴豆中总生物碱质量分数。结果酸性染料法的显色条件为加pH 6.0缓冲液至8 mL,加溴麝香草酚蓝3.5 mL,振摇3 min,静置40 min,三氯甲烷8mL萃取,测定波长为420 nm,在0.024 6～0.147 3 mg范围内线性关系良好(r=0.999 5),平均回收率99.0%,RSD为2.75%。结论本含量测定方法操作简单,灵敏度高,准确性、重复性好,可用于巴豆中总生物碱的含量测定。

巴豆生物碱对人胃癌细胞SGC-7901表型逆转作用研究

目的:研究巴豆生物碱对人胃癌细胞SGC-7901表型逆转作用。方法:测定人胃癌细胞SGC-7901药物处理前后胃蛋白酶原(PG)和β-葡萄糖醛酸酶(β-G)活力,数据采用Scheffe's测试法分析。结果:巴豆生物碱处理能有效逆转人胃癌细胞SGC-7901中胃蛋白酶原活性,且能部分抑制人胃癌细胞SGC-7901中肿瘤标志酶β-葡萄糖醛酸酶的表达。结论:巴豆生物碱对人胃癌细胞SGC-7901表型有逆转作用。在对胃蛋白酶原活性的逆转作用和对β-葡萄糖醛酸酶的表达的抑制作用较维甲酸好。

巴豆生物碱对人胃癌细胞SGC-7901的诱导分化作用研究

以人胃癌细胞SGC -790 1为研究材料 ,胃细胞分化标志酶碱性磷酸酶 (ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)为实验指标 ,观察人胃癌细胞SGC -790 1在含有不同剂量巴豆生物碱培养液中的生长情况 ,结果发现经不同剂量巴豆生物碱处理的细胞 ,其碱性磷酸酶 (ALP)和乳酸脱氢酶 (LDH)的活力显著低于培养相同天数而未用巴豆生物碱处理的对照胃癌细胞 ,显示了巴豆生物碱对胃癌细胞具有诱导分化作用。

巴豆总生物碱的纯化工艺研究

目的研究大孔树脂分离纯化巴豆总生物碱的工艺。方法采用分光光度法测定总生物碱,筛选HPD400、AB-8、NKA-9、ADS-17、D101树脂对巴豆总生物碱的吸附和解吸附能力,并优化分离纯化条件。结果优选出D101树脂,上样液浓度为生药1.5 g mL-1,吸附流速1.5 BV h-1,药材量:树脂量=9:2,4 BV水除杂后用4 BV 30%乙醇冲洗收集目标滤液。结论该方法简便易行,适合于巴豆总生物碱的分离纯化。

巴豆生物碱对人骨肉瘤细胞细胞周期 凋亡及对Bcl-2基因表达的影响

目的:了解巴豆生物碱诱导人骨肉瘤细胞细胞周期、凋亡效果,以及凋亡与Bcl-2表达之间的关系。方法:用不同浓度的紫杉醇作用于骨肉瘤细胞MG63。分别采用MTT法和流式细胞术(Annexin-V-FITC&PI)检测巴豆生物碱对MG63细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡进行检测。采用免疫组织化学法对凋亡调节基因Bcl-2表达进行检测。结果:巴豆生物碱抑制了MG63细胞增殖,并呈现剂量、时间依赖性。随着巴豆生物碱的作用时间延长,G0/G1期细胞比例明显下降,而较多的细胞阻滞于G2/M期。巴豆生物碱的作用浓度从10μg/mL增至200μg/mL,则平均细胞凋亡率从17.40%上升为75.80%。巴豆生物碱可以降低凋亡相关基因Bcl-2的表达。结论:巴豆生物碱可以通过时间依赖性和剂量依赖性方式,促使细胞G2/M期阻滞和抑制细胞有丝分裂,从而诱导人骨肉瘤细胞凋亡。这种凋亡可能受到凋亡相关基因Bcl-2低表达。

巴豆生物碱诱导Hela细胞凋亡及其作用机制

目的研究巴豆生物碱(CA)在体外诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其作用机制。方法 MTT法检测CA对Hela细胞增殖的抑制率;AnnexinV-PI染色检测细胞凋亡;Caspase-8试剂盒检测Caspase-8在Hela细胞中的活性;RT-PCR检测Caspase-8 mRNA的表达。结果巴豆生物碱对Hela细胞生长有抑制作用,且呈剂量依赖关系。流式细胞术结果提示CA可诱导Hela细胞凋亡。CA处理Hela细胞后发现Caspase-8活性明显增加,Caspase-8的mRNA高表达。结论 CA对人宫颈癌Hela细胞有增殖抑制和诱导凋亡作用,其诱导Hela细胞凋亡的分子机制可能与上调Caspase-8基因表达有关。

巴豆生物碱对Lewis小鼠肺腺癌细胞生长和凋亡的影响及机制研究

目的通过研究巴豆生物碱(CA)对Lewis小鼠肺腺癌细胞生长及对凋亡相关蛋白(Survivin、Caspase-3、Bax)、YAP蛋白的调控作用,探讨CA对肺腺癌细胞生长和凋亡的影响及其具体的作用机制。方法培养Lewis鼠源性肺腺癌细胞(LLC),复制小鼠皮下成瘤模型,分为5组,每组10只,分别为对照组、低剂量CA组、中剂量CA组、高剂量CA组及顺铂组。皮下成瘤1周后给予药物干预,第22天对5组小鼠取瘤称重,计算抑瘤率并通过光学显微镜观察各组病理形态学的变化,判断CA对瘤体生长的抑制作用;Western blotting检测Survivin、Caspase-3、Bax及YAP蛋白相对表达量;qRT-PCR法检测Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA相对表达量。结果中剂量CA组和高剂量CA组小鼠的一般生存状态较对照组、低剂量CA组及顺铂组好。低剂量CA组、中剂量CA组、高剂量CA组及顺铂组肿瘤细胞出现不同程度细胞凋亡现象,对照组肿瘤细胞多为坏死细胞。低剂量CA组、中剂量CA组、高剂量CA组及顺铂组的抑瘤率分别是13.91%、14.83%、27.84%和68.45%,4组抑瘤率比较,差异有统计学意义(P<0.05),各组抑瘤率依次升高,顺铂组肿瘤生长最慢。不同剂量CA组中Survivin mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05),CA剂量越高,Survivin mRNA相对表达量越低;而不同剂量CA组中Caspase-3和Bax mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05),CA剂量越高,Caspase-3和Bax mRNA的相对表达量越高;各组YAP mRNA的相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论CA对Lewis肺腺癌小鼠瘤体生长有抑制作用,并引起细胞凋亡。CA通过促进Bax和Caspase-3表达及抑制Survivin表达来调控Lewis小鼠肺腺癌细胞凋亡;其调控机制可能是通过下调Survivin的表达,从而使得Survivin对Caspase-3的抑制作用减弱,而Bax上调可进一步激活Caspase-3,从而诱导Caspase级联效应促进细胞凋亡,为肺腺癌治疗提供了新思路。

巴豆生物碱调控miR-4317对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的探讨巴豆生物碱(crotonic alkaloids,CA)对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制。方法体外培养人结直肠癌细胞SW620,不同浓度的CA处理SW620细胞,脂质体转染法将miR-NC、miR-4317 mimics分别转染至SW620细胞,将anti-miR-NC、anti-miR-4317分别转染至SW620细胞后加入100μg/ml巴豆生物碱处理24 h;MTT实验检测细胞增殖;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;qRT-PCR法检测miR-4317的表达量。结果CA处理SW620细胞后,miR-4317的表达量和细胞增殖抑制率升高(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞克隆形成数减少(P<0.05),且呈剂量依赖性;转染miR-4317 mimics后,细胞增殖抑制率升高(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞克隆形成数减少(P<0.05);转染anti-miR-4317可降低CA对SW620细胞增殖及凋亡的作用。结论巴豆生物碱可通过上调miR-4317的表达而抑制结直肠癌细胞增殖并可诱导细胞凋亡。

巴豆生物碱部位HPLC特征指纹图谱研究

目的:建立巴豆生物碱部位的高效液相指纹图谱。方法:色谱柱Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm,5μm),甲醇-0.2%乙酸水流动相系统梯度洗脱,流速0.8 mL.min-1,检测波长292 nm,温度28℃。结果:对10批巴豆药材进行了测定,建立了巴豆生物碱部位的指纹图谱,共有13个共有峰,指认了两种主要生物碱巴豆苷和木兰花碱。结论:该方法可为巴豆的研究和质量控制提供依据。

巴豆生物碱药动学研究及体内抗肺癌作用初步评价

目的肺癌是常见的恶性肿瘤,巴豆生物碱(crolon alkaloid,CA)具有抑制肺癌细胞生长并促进其凋亡的作用。本研究旨在评价CA注射给药后的药动学及抗肺癌的药效学。方法以CA为原料,制成CA注射剂;SD大鼠为模型,考察1.2mg/kg剂量单次注射后巴豆苷和木兰花碱的药时曲线、总体暴露量、半衰期等相关药动学参数。将48只荷瘤裸鼠随机分成模型组、阳性对照组和巴豆生物碱组,每组16只,皮下接种A549(人源肺癌)细胞建立异位肺癌裸鼠模型。CA组荷瘤裸鼠以1.2mg/kg剂量(以CA剂)连续注射7d,考察肿瘤生长曲线、肿瘤质量、体质量、肝脾指数及生存时间等指标,并采用SPSS 16.0进行统计学分析。结果大鼠血浆中巴豆苷和木兰花碱在1~500ng/mL范围内具有较好的线性关系,巴豆苷的线性方程为y=0.025 1x+0.134(r=0.998 7),木兰花碱的线性方程为y=0.003 8x+0.027(r=0.999 5),且它们的提取回收率、稳定性及测定的精密度和准确度均符合生物样品测定要求。CA经单次注射后,巴豆苷的总体暴露量(AUC0-∞)为(157.2±43.1)μg·h/L、半衰期(t1/2)为(3.9±0.6)h;木兰花碱的总体暴露量(AUC0-∞)为(23.9±7.2)μg·h/L,半衰期(t1/2)为(4.3±1.8)h。经CA治疗7d后,荷瘤裸鼠的肿瘤生长被明显抑制(F=12.55,P=0.036),抑瘤率为53.62%;平均生存时间明显延长(F=37.62,P<0.001),平均生存时间为30d;且体质量、肝指数及脾指数均未出现明显异常(F值分别为2.01、2.98、4.23,均P>0.05)。结论 CA具有较好的体内暴露量(area under the concentration versus time curve,AUC),能够显著抑制肺癌的生长,实现肺癌的治疗。

巴豆生物碱通过ERK1/2通路对脑缺血再灌注大鼠海马神经元损伤及自噬的影响

目的 探讨巴豆生物碱(Croton alkaloids,CA)通过细胞外调节蛋白激酶1/2(Extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)通路对脑缺血再灌注大鼠海马神经元损伤及自噬的影响。方法 50只大鼠建立大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,造模成功大鼠(48只),并随机分为模型组(12只)、CA低剂量组(12只)、CA中剂量组(12只)和CA高剂量组(12只),其余10只为对照组;CA低、中和高剂量组分别注射0.6、1.2、2.4 mg/kg的CA注射液,连续注射7 d;对照组及模型组给予等量生理盐水注射;应用神经功能评分法评定大鼠神经功能缺损和改善情况;苏木精-伊红染色法(Hematoxylin eosin staining,HE)检测大鼠脑组织海马神经元的形态及数量;原位末端转移酶标记法(Terminal uridine nick end labeling,TUNEL)检测大鼠脑组织细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应(Real time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠海马ERK1/2、哺乳动物同源蛋白(Mammalian homologous protein,Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3-Ⅱ)mRNA和蛋白表达水平。结果 与模型组比较,CA低、中、高剂量组神经功能评分、p-ERK1/2蛋白表达水平提高,神经细胞凋亡率、Beclin-1,LC3-ⅡmRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05);与CA低剂量组比较,CA中、高剂量组神经功能评分、p-ERK1/2蛋白表达水平提高,神经细胞凋亡率、Beclin-1,LC3-ⅡmRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05);与CA中剂量组比较,CA高剂量组神经功能评分、p-ERK1/2蛋白表达水平提高,神经细胞凋亡率、Beclin-1,LC3-ⅡmRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论 CA可降低MCAO大鼠神经细胞凋亡率,在一定程度上修复MCAO大鼠神经功能,发挥神经保护作用,其机制可能与激活ERK1/2信号通路有关。