基于胚胎干细胞模型的Cry1Ab蛋白发育毒性

目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性。方法:设置Cry1Ab蛋白7个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3。通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50%inhibition concentration of growth and viability, IC_(50))。设置Cry1Ab蛋白5个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以5-FU为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies, EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50%inhibition concentration of differentiation, ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction, qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5和β-MHC)的mRNA表达情况。结果:5-FU的IC_(50,3T3)为46.37μg/L,IC_(50,ES)为32.67μg/L,ID_(50,ES)为21.28μg/L,根据判别函数结果将5-FU分类为强胚胎毒性物质。不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P>0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P<0.05),且具有剂量依赖趋势(P<0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P<0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验模型中未观察到31.25~2 000.00μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性。

利用胚胎干细胞骨分化实验评价Cry1Ab蛋白的发育毒性

目的通过小鼠胚胎干细胞骨分化实验研究Cry1Ab蛋白对胚胎干细胞成骨分化过程的影响,以评估Cry1Ab蛋白的发育毒性。方法以Cry1Ab蛋白为受试物,设置5个剂量(125,250,320,1000,2000 ng/ml)染毒小鼠胚胎干细胞形成的拟胚胎体(embryonic body,EB),设置溶剂对照和阳性对照,同时向培养基中添加β-甘油磷酸盐(10 mmol/L)、抗坏血酸(50μg/ml)和维生素D3(500μmol/L)诱导EB向骨细胞分化,通过茜素红S染色和吸光度检测确定骨细胞钙化结节生成情况;收集EB制备细胞裂解液,通过BCA法测量细胞总蛋白浓度,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒检测细胞裂解液中ALP活性;收集EB样本提取总RNA,通过qPCR检测骨细胞分化相关标志物Runx2、SPARC和I型胶原的基因表达情况。结果与对照组相比,不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的EB细胞团大小、钙化结节数量无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的细胞总蛋白浓度和ALP活性与对照组相比无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的Runx2、SPARC和I型胶原基因表达水平与对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。结论本次试验中,未观察到Cry1Ab蛋白对小鼠胚胎干细胞成骨分化过程产生影响,125~2000 ng/ml的Cry1Ab蛋白不具有发育毒性。

转基因抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白的时空表达分析

玉米是我国最重要的粮食作物之一,虫害会造成严重的品质和产量损失,转Bacillus thuringiensis(Bt)基因抗虫玉米为玉米害虫的防治提供了新途径。转Bt基因抗虫玉米的抗虫性与外源杀虫蛋白表达量具有密切的关系,明确Bt杀虫蛋白在不同生育期和不同器官中的表达量,对害虫的综合防治和农业转基因生物安全管理具有重要意义。连续两年采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了9个地点种植的瑞丰125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量,对比分析了玉米拔节期(V6-V8)叶片、抽雄期(VT)雄穗、吐丝期(R1)叶片和花丝、成熟期(R4)叶片和籽粒的Bt杀虫蛋白含量,结果表明Bt杀虫蛋白表达量在不同玉米器官中差异较大。2年9个地点的数据整体上呈现出叶片中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较高,而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较低的规律。9个地点种植的瑞丰125的Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量有所差异,但差异整体较小。

Identification and Evaluation of Insect and Disease Resistance in Transgenic Cry1Ab13-1 and NPR1 Maize

PCR detection,quantitative real-time PCR(q-RTPCR),outdoor insect resistance,and disease resistance identification were carried out for the detection of genetic stability and disease resistance through generations(T2,T3,and T4)in transgenic maize germplasms(S3002 and 349)containing the bivalent genes(insect resistance gene Cry1Ab13-1 and disease resistance gene NPR1)and their corresponding wild type.Results indicated that the target genes Cry1Ab13-1 and NPR1 were successfully transferred into both germplasms through tested generations;q-PCR confirmed the expression of Cry1Ab13-1 and NPR1 genes in roots,stems,and leaves of tested maize plants.In addition,S3002 and 349 bivalent gene-transformed lines exhibited resistance to large leaf spots and corn borer in the field evaluation compared to the wild type.Our study confirmed that Cry1Ab13-1 and NPR1 bivalent genes enhanced the resistance against maize borer and large leaf spot disease and can stably inherit.These findings could be exploited for improving other cultivated maize varieties.

国产Bt-Cry1Ab和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾的抗性测定

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)是世界性重大农业害虫。种植转基因Bt作物是主要的防治手段之一。我们利用室内生物测定方法评价了国产Bt-Cry1Ab玉米(转化体C0030.3.5)和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米(转化体DBN3601和DBN3608)对草地贪夜蛾1~4龄幼虫的毒力。结果显示,供试两种转基因玉米共6个品种皆可高效表达目标杀虫蛋白并对草地贪夜蛾具有很强的毒杀作用,对1龄幼虫的致死率达到59%~100%,存活幼虫的生长发育亦受到显著抑制。表明国内研发的Bt-Cry1Ab玉米和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾具有良好的控制效果,其中Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米的防治效果显著优于Bt-Cry1Ab玉米,两种转基因玉米皆具有较好的商业化应用前景。

转基因高粱Cry1Ab蛋白含量的比较研究

通过农杆菌介导法将杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入高粱恢复系115中,共获得13个独立的转基因株系,26株转基因植株,转化率为5.1%;GUS活性、PCR、Southern和Western杂交分析表明,此基因已整合进高粱基因组并得到正确表达。利用ELISA试剂盒测定Cry1Ab蛋白含量,结果表明,不同转基因植株的Cry1Ab蛋白含量有明显差异,最高可达0.850μg/g,占可溶性蛋白的0.016%,还有一些转基因植株中不能表达;同一转基因植株的不同组织中表达量有明显差异,其顺序为:叶>颖壳>籽粒>根>茎;不同部位的叶片也有差异,其顺序为:中部叶>基部叶>新叶。

Cry1Ab杀虫蛋白在水稻-褐飞虱-拟水狼蛛食物链中转移与富集

采用ELISA方法检测了2个转 cry1Ab 基因水稻 (Bt水稻) 品系KMD1和KMD2不同生育期叶鞘内Cry1Ab杀虫蛋白的含量及其通过褐飞虱和拟水狼蛛的转移和富集情况。结果表明, 这2个品系中抽穗期和黄熟期叶鞘内Cry1Ab的含量均显著低于苗期、分蘖期和孕穗期, KMD1和KMD2中Cry1Ab杀虫蛋白可以通过食物链转移到Bt水稻非靶标害虫褐飞虱及其天敌拟水狼蛛体内。褐飞虱在KMD1或KMD2上取食2 d后, 体内均含有 Cry1Ab杀虫蛋白, 但连续取食2、4、6、8和10 d后,其体内含量并未因取食时间的延长而呈现明显增加的趋势。当拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时, 在捕食2、4、6、8和10 d后, 其体内均可检测到Cry1Ab杀虫蛋白, 其含量并未随捕食时间的延长而明显上升, 但均显著高于相应时间褐飞虱体内的含量。可见, 该蛋白可通过水稻转移至褐飞虱, 再转移至拟水狼蛛, 并存在明显的富集现象, 而这种富集并不随蜘蛛捕食时间的延长而加强。拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时, 其捕食量未受到显著影响, 其中肠酶粗提物对Cry1Ab杀虫蛋白具有明显的降解作用。

转cry1Ab基因水稻对拟水狼蛛捕食作用间接影响的评价

室内评价了拟水狼蛛 (Pirata subpiraticus)对取食转 cry1Ab基因水稻的稻纵卷叶螟 (Cnaphalocrocis medinalis)幼虫和褐飞虱 (N ilaparvata lugens)若虫的捕食量及功能反应。结果表明 ,拟水狼蛛对这 2种猎物的捕食功能反应均符合Holling 型圆盘方程。该蜘蛛对取食转 cry1Ab基因水稻的稻纵卷叶螟幼虫的捕食量和处理时间低或短于取食对照的 ,但差异未达显著水平 ,而瞬时攻击率显著低于对照。该蜘蛛对以转 cry1Ab基因水稻为食的褐飞虱若虫的捕食量、瞬时攻击率和处理时间与取食对照的相比有一定的变化 ,但差异均不显著。综合考虑 ,认为转 cry1Ab基因水稻对拟水狼蛛捕食作用无明显的负作用。

转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。

Bt水稻Cry1Ab杀虫蛋白表达的时间动态及其在水稻土中的降解

采用ELISA技术检测了Bt水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)不同生育期茎和叶片中cry1Ab基因的表达水平,以及植株组织(茎和叶片)室内埋于不同稻田土壤中其Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态。结果表明,不论是KMD1还是KMD2,茎和叶片中cry1Ab基因的表达量为3.7～9.1μg/g鲜重,均以拔节期和孕穗期相对较低,灌浆初期显著升高,黄熟期又明显下降(但仍然维持在较高的表达量)。KMD1茎和叶片中Cry1Ab蛋白在3种水稻土即青紫泥田、黄松田和黄筋泥田中的降解,均以前期(处理后12d内)较快,但中后期明显较慢;处理后42d,这两种组织中的Cry1Ab残留量均稳定在μg级水平,分别仅有0.20～0.85μg/g干重和0.35～1.81μg/g干重。KMD1茎和叶片中Cry1Ab蛋白降解动态与土壤类型密切相关,青紫泥田中降解最快,黄筋泥田中次之,黄松田中最慢。淹水可加快土壤中茎和叶的腐解,从而促进其中Cry1Ab蛋白的降解。KMD2粉碎叶中Cry1Ab蛋白在有菌水稻土中的降解快于无菌土中,表明土壤微生物存在可加快Cry1Ab蛋白的降解。在各种土壤淹水与非淹水、灭菌与非灭菌处理条件下的Cry1Ab蛋白降解过程均可用指数方程进行拟合,算得其消减半衰期为2.2～11.6d不等。讨论了土壤类型、淹水等影响Cry1Ab蛋白降解的可能机制,认为土壤微生物是其中起关键作用的一个因子。

转Btcry1Ab基因水稻对稻田弹尾虫种群数量的影响

以转Btcry1Ab基因水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)及其亲本非转基因水稻秀水11(XS11)为材料,于2003年9月和翌春4月,调查了KMD1和KMD2对水稻灌浆期和收割后休田期稻田土表落叶层中弹尾虫种群数量的影响.结果表明,KMD植株表达的cry1Ab杀虫蛋白可在稻田环境中残留160d以上;在水稻灌浆期采用吸虫器法在稻田落叶层中采集到灰橄榄长角跳虫(Entomobrya griseoolivata)和钩圆跳虫(Bourletiella christianseni)等2种弹尾虫,其中灰橄榄长角跳虫在KMD1和KMD2稻田中的种群密度显著高于XS11稻田;在水稻收割后休田期采用网袋法采集到灰橄榄长角跳虫、钩圆跳虫、球角跳虫(Hypogastrura matura)和等节跳虫(Isotoma monochaeta)等4种弹尾虫,其中转Bt基因水稻稻田中的灰橄榄长角跳虫和球角跳虫的种群密度显著高于XS11稻田,且其植株组织残体生物量损失率显著高于XS11.

含Cry1Ab和Xa21基因抗病虫水稻选育研究及其田间表现

以稳定遗传的含Cry1Ab基因的抗虫水稻品种镇稻88和含Xa21基因的抗白叶枯病水稻品种圣稻301为亲本进行杂交,利用选择标记基因(bar基因和gus基因)和Southern杂交分析研究了转基因在杂交后代中的遗传分离规律和遗传稳定性。实验结果表明,在杂交后代中选择标记基因bar基因和gus基因分别与抗性基因Cry1Ab基因和Xa21基因紧密连锁并协同表达。Basta抗性检测和GUS活性的组织化学染色检测显示,Cry1Ab基因和Xa21基因在F2代中遵循9∶3∶3∶1的孟德尔遗传规律,F3代的部分株系中Cry1Ab基因和Xa21基因已稳定纯合;对F3代和杂交亲本的Southern杂交分析表明,Cry1Ab基因和Xa21基因可稳定地遗传。通过田间选育,获得了农艺性状优良的双抗(抗螟虫、白叶枯病)转基因水稻新品系SK-1、SK-2、SK-3,3个品系均对二化螟和白叶枯病菌表现出显著的抗性,产量高于镇稻88和圣稻301近20%,品质与镇稻88和圣稻301相近,部分指标优于这两个品种。

转Cry1Ab基因水稻分子特征及其特异性PCR检测方法

转Cry1Ab基因水稻Bt01为一种新型的转基因水稻,文章首先利用Southern blotting验证了外源基因Cry1Ab转入了Bt01中,且为单拷贝,再利用TAIL-PCR方法获得了其插入位点信息,根据获得的Bt01的5′端插入位点序列,设计了相应的定性与定量PCR检测体系的引物及探针,实验结果显示,定性PCR检测体系的最低检测极限(LOD)为10个拷贝,定量PCR检测体系的LOD为5拷贝,最低定量极限(LOQ)为10拷贝。同时为了验证建立的定量PCR体系的准确性,利用该体系检测已知转基因水稻Bt01含量分别为3%和0.5%的样品,定量结果分别为2.7%和0.47%。研究结果表明,该转化体特异性定性与定量检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因水稻Bt01的身份识别和检测提供了有效的方法。

转Bt基因抗虫玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

【目的】研究转cry1Ab杀虫蛋白基因玉米收获后玉米根茬及其根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态,比较两种Bt玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定玉米收获后根茬残体和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态。【结果】转Bt基因玉米根茬残体和根际土壤中杀虫蛋白是逐渐降解的,Bt玉米MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较高,降解的速度也较慢,收获后8个月时还不能完全降解;Bt玉米Bt11根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较低,降解速度比MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度快,到7个月时已检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。Bt玉米MON810根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解较Bt11的慢,MON810和Bt11根际土壤分别在8个月和7个月时检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。【结论】种植过Bt11和MON810抗虫玉米的田块,在第二年春播农作物已经出土时,其根茬和根际土壤中残留的Cry1Ab杀虫蛋白尚不能完全降解,还有少量残留。

转cry1Ab/vip3H基因水稻对非靶标害虫褐飞虱连续多代生长发育与繁殖的影响

实验室条件下,转cry1Ab/vip3H基因水稻G6H1对褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育与繁殖的继代效应评价结果表明,不论是在苗期或是成株期,在各水稻品种上连续饲喂褐飞虱4代后,该虫各代的生长发育和繁殖参数都没有受到水稻品种的显著影响,即不论是在第1代、第2代还是第4代,取食G6H1与取食其非转基因亲本Xiushui 110相比,褐飞虱若虫的发育时间、成虫寿命和产卵量都没有显著差异。同时,2008年和2009年的田间调查结果表明,G6H1和Xiushui 110稻田间褐飞虱的若虫、成虫和成若虫总密度均无显著差异。

抗虫基因cry1Ab/Ac在水稻杂交转育后代中的表达效应

以转入了Bt基因cry1Ab/Ac的水稻品系TT51为供体,与10个恢复系杂交。通过分子检测,并结合田间的抗虫性观察,筛选出农艺性状良好的转基因纯合株系。抗虫基因在所有的杂交组合后代中按照孟德尔规律遗传,但是不同遗传背景下的表达量有很大差异。Cry1Ab/Ac蛋白含量维持原有水平的株系对螟虫表现出良好的抗性,蛋白含量降低的株系则受到轻微的危害。纯合株系的部分农艺性状发生变异,其程度与Cry1Ab/Ac蛋白含量有关。结果为利用杂交转育培育优良抗虫水稻提供依据。

转Bt基因抗虫玉米植株叶腋处花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

以表达Cry1Ab杀虫蛋白的两种转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法研究了玉米散粉时沉积在植株叶腋处Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态,比较了两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度.结果表明,Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白是逐渐降解的,且降解速度逐渐加快.但两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,MON810中的Bt杀虫蛋白降解较快,而Bt11中的降解较慢.d15时在MON810叶腋处的花粉中已经检测不到Bt杀虫蛋白,而在Bt11花粉中Bt杀虫蛋白到d18才完全降解.两种Bt玉米花粉中杀虫蛋白的初始含量差异显著,且在各个取样时间内Bt杀虫蛋白的残留量存在显著差异.玉米散粉时留在田间的Bt玉米花粉中的Cry1Ab杀虫蛋白不会在自然界累积.

转cry1Ab基因水稻田寄生蜂亚群落结构及其优势类群数量动态的研究

从寄生蜂的优势度、数量和时间动态等方面,对含cry1Ab基因的Bt水稻对稻田寄生蜂群落的影响作了评价。寄生蜂各科的组成与优势度的分布在Bt稻田和对照间无显著差异,但数量低于对照,其中,优势类群茧蜂数量显著低于对照。从田间动态看,仅在寄生蜂发生的高峰期,Bt稻田中的主要寄生蜂才显著低于对照。因此,Bt水稻对靶标害虫主要寄生蜂尤其是茧蜂可能具一定的负面影响。

Cry1Ab蛋白对稻纵卷叶螟幼虫体内三种保护酶活性的影响

室内采用酶活力测定方法研究转B t基因水稻表达的Cry1Ab蛋白对稻纵卷叶螟幼虫体内3种保护酶(AChE、SOD和CAT)活性的影响。结果表明,用转B t基因水稻处理稻纵卷叶螟幼虫,饲喂4 h、36 h后,其体内AChE活力分别比对照增加了52.09%、128.51%,并且都极显著(P<0.01)高于对照组;取食转基因水稻叶片4 h后,幼虫体内SOD酶活性比对照提高了91.5%,与对照有显著差异;36 h后活性达到最大值,但与对照差异不显著。取食转基因水稻叶片24 h后,幼虫体内CAT酶活性达到最大值且高于对照,但与对照差异不显著;48 h后酶活性受到显著抑制,与对照差异显著。同时,测定了幼虫体内及其粪便中Cry1Ab蛋白含量的变化,结果表明,取食转基因水稻叶片12 h后,进入体内的Cry1Ab蛋白随粪便排出,幼虫体内的Cry1Ab蛋白含量一直低于粪便中的含量,且在24 h时两者差异达到最大。由于Cry1Ab蛋白在幼虫体内的积累,扰乱了稻纵卷叶螟幼虫体内AChE、SOD和C AT保护酶的动态平衡,使虫体内自由基的清除遇到障碍,从而对其产生毒害作用。