转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM0304叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。

超声波辅助花粉介导法获得转BtCry1Ac基因玉米的研究

为了进一步分析玉米基因功能及基因转化,并为玉米抗虫提供种质资源,利用超声波辅助花粉介导法,将抗虫基因Cry1Ac导入玉米优良自交系昌7-2中,获得大量的转基因植株。结果表明:转基因植株经过草铵膦抗性筛选、PCR检测、BT蛋白试纸条检测和室内抗虫性鉴定等分析,最后获得高抗玉米螟的转BtCry1Ac基因株系9个。培育出了高抗玉米螟的种质资源材料,同时也建立了超声波辅助花粉介导转化玉米的高效转化体系,该方法是简捷、快速有效、无基因型限制的植物转化方法。

转BtCry1Ac基因对107杨材性的非预期影响

为了探究外源BtCry1Ac基因对107杨材性性状产生的非预期影响,以转BtCry1Ac基因107杨2个株系(ECA1和ECA2)和野生型株系(WT)为材料,对其木材化学组分、物理和力学性质及纤维形态指标进行了定量测定。结果显示:BtCry1Ac基因的转入使107杨木材材性发生了非预期变化,具体表现为ECA1和ECA2的纤维素、灰分、苯醇抽出物及1%NaOH抽出物组分含量均显著低于WT(P<0.05);ECA1和ECA2的气干干缩性、全干干缩性显著低于WT(P<0.05),且ECA1和ECA2的气干密度、全干密度显著高于WT(P<0.05);ECA1和ECA2的冲击韧性、抗弯强度、抗弯弹性模量和顺纹抗压强度均显著高于WT(P<0.05);ECA1和ECA2的纤维长度显著低于WT(P<0.05)。总体表现为转基因株系的木材有着更小的干缩性,更高的密度和强度,其材性发生了非预期性改变,研究结果为转基因杨树的推广与应用提供了参考。

转BtCry1Ac基因107杨生长分析

以4个7年生转BtCry1Ac基因107杨无性系及其未转基因对照为材料,对河北深州市、枣强县和盐山县3个地点营建的对比试验林进行调查,对其生长进行分析,探究外源基因的转入对其生长产生的影响。结果表明,转基因株系间平均树高、胸径、材积无显著差异,但均显著低于未转基因对照。转基因株系在不同试验林生长量表现不同,枣强试验林与盐山、深州试验林在生长量方面均存在显著差异,盐山试验林表现最好,枣强试验林平均树高、胸径、材积仅为盐山的86.5%、84.8%、65.1%。多点联合方差分析表明,株系与地点之间互作明显。转基因株系与对照树高、胸径、材积方面,在速生期、年平均最大生长量等时期较为相近,生长模式基本相同。

转Cry1Ac基因抗虫玉米Bt-799对田间节肢动物群落多样性的影响

【目的】安全评价是转基因品种研发的重要保障,为明确转基因玉米Bt-799在生物多样性影响方面的安全性,并为其在吉林春玉米区种植提供安全保证,开展了转基因玉米Bt-799对田间节肢动物群落多样性影响的研究。【方法】综合利用直接观察法和地面陷阱法,以多样性指数、均匀度指数、优势度指数等参数以及主要种群动态作为评价指标,系统研究转基因玉米Bt-799对田间节肢动物群落多样性的影响。【结果】转基因玉米Bt-799较之对应的非转基因对照郑58在田间节肢动物群落结构参数、主要种群动态等方面均无显著差异。【结论】转Cry1Ac基因玉米Bt-799在吉林省种植,不会对田间节肢动物群落多样性造成显著不良影响。

农杆菌介导Cry1 Ab/Ac抗虫转基因玉米植株的获得

转基因技术的迅速发展有效地打破了物种间的遗传壁垒,从而加快了优良基因定向聚合的进程,然而遗传转化率低及转基因安全问题成为制约其进一步发展的限制因素。基于此,本研究以玉米自交系H99为材料,将Ac/Ds双元表达载体(包含抗虫Cry1 Ab/Ac基因和gfp报告基因等)通过农杆菌介导法转入由110粒玉米幼胚诱导出的愈伤组织中,获得28株抗性转基因植株。经PCR及RT-PCR的验证结果显示,其中8株为含有Cry1 Ab/Ac目的基因且该基因有效表达的阳性植株,转化效率达7%。通过农杆菌介导法所获得的玉米转基因植株为今后剔除抗生素筛选标记,从而获得安全的玉米抗虫新种质提供了遗传材料。

利用CRISPR/Cas9基因编辑片段敲除技术创制玉米多样化等位变异

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制等位变异已经成为众多植物中增加种质资源多样性的重要手段。提高玉米等谷物中类胡萝卜素含量是发展中国家解决维生素A缺乏症的一种经济方法。本研究以玉米中调控类胡萝卜素合成的基因crtRB1为研究对象,利用双靶标片段缺失性基因编辑技术,在原生质体中对crtRB1的启动子顺式元件进行片段敲除,获得了具有片段缺失和InDel(插入或缺失)的多样化等位变异,这为在玉米中实现稳定的crtRB1启动子元件的缺失突变奠定了基础,对启动子元件的功能研究和玉米的品质改良具有重要意义。

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zea mays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的Cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因,构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体,表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白.用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中,轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选,获得可育的再生植株.经PCR及Southern blot分子检测,证实所获得的再生植株为转基因植株.抗虫性分析结果表明,部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性.

转基因玉米对田间节肢动物生物多样性及虫害发生的影响

【目的】明确转基因抗虫(cry1Ab)耐除草剂(epsps)玉米DBN9936对田间节肢动物生物多样性及虫害发生的影响,为转基因作物的生物安全提供数据支持。【方法】在田间隔离条件下,采用直接观察法对田间节肢动物种类和数量进行统计,采用剖杆法调查钻蛀类害虫的危害情况。分析比较转基因玉米宏硕1799转化体和远科105转化体及其非转基因玉米受体品种、非转基因玉米栽培品种先玉335的田间节肢动物功能群、丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀性指数、优势集中性指数等相关参数。【结果】1)转基因玉米与非转基因玉米受体品种的田间节肢动物丰富度指数、多样性指数、均匀度指数、优势集中性指数随时间变化趋势基本一致;2)转基因玉米的叶片平均受害率、茎秆平均受害率和穗尖平均受害率均低于非转基因玉米;3)转基因玉米与喷施杀虫剂的非转基因玉米上玉米螟、棉铃虫和黏虫等鳞翅目害虫的危害程度均较非转基因玉米有不同程度的降低。【结论】与非转基因对照玉米相比,受试转基因玉米有降低鳞翅目靶标害虫发生的趋势,且对田间节肢动物生物多样性无明显影响。

转基因抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白的时空表达分析

玉米是我国最重要的粮食作物之一,虫害会造成严重的品质和产量损失,转Bacillus thuringiensis(Bt)基因抗虫玉米为玉米害虫的防治提供了新途径。转Bt基因抗虫玉米的抗虫性与外源杀虫蛋白表达量具有密切的关系,明确Bt杀虫蛋白在不同生育期和不同器官中的表达量,对害虫的综合防治和农业转基因生物安全管理具有重要意义。连续两年采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了9个地点种植的瑞丰125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量,对比分析了玉米拔节期(V6-V8)叶片、抽雄期(VT)雄穗、吐丝期(R1)叶片和花丝、成熟期(R4)叶片和籽粒的Bt杀虫蛋白含量,结果表明Bt杀虫蛋白表达量在不同玉米器官中差异较大。2年9个地点的数据整体上呈现出叶片中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较高,而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较低的规律。9个地点种植的瑞丰125的Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量有所差异,但差异整体较小。

转Cry1Ac-w基因抗虫玉米的获得及分子鉴定

为将改造合成的抗虫基因(Cry1Ac-w)导入玉米基因组,以玉米杂交组合PA×PB的胚性愈伤组织为外植体,用双丙氨磷作为抗性愈伤组织的筛选剂,通过农杆菌介导法获得了82个再生植株。经标记基因(bar)和目的基因(Cry1Ac-w)的PCR检测,其中19株为阳性,即为推断的转Cry1Ac-w基因抗虫玉米。对其中2株(w1和w2)进行目的基因单酶切的Southern杂交分析,发现w1和w2分别为单位点和双位点插入,这也进一步证实目的基因已经整合入玉米基因组中。用Bt-Cry1Ab/Ac金标免疫试纸条进行蛋白质表达的检测,初步证实目标Cry1Ac-w蛋白在玉米中得到表达。

玉米生物钟基因ZmPRR 1-2的克隆及表达分析

为探究玉米生物钟基因ZmPRR 1-2的功能及表达特性,解析玉米光周期途径调控开花的机理,该研究以玉米骨干自交系‘黄早4’为材料,克隆ZmPRR 1-2基因的cDNA序列并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析和48 h的昼夜节律表达分析。结果表明:(1)成功克隆获得ZmPRR 1-2基因的编码区全长1554 bp,编码517个氨基酸,编码的蛋白属于PRR基因家族,含有1个REC结构域和1个CCT结构域,多序列比对和系统进化分析显示ZmPRR 1-2基因在禾本科植物中高度保守;ZmPRR1-2蛋白属亲水性蛋白,不包含跨膜结构域和信号肽。(2)ZmPRR 1-2基因在玉米叶片中的表达量最高,显著高于其他7个组织,表明该基因主要在叶片中发挥功能,而在果穗和花丝中表达量相对较低,且显著低于雄穗中的表达量。(3)昼夜节律表达分析显示,在短日照条件下,ZmPRR 1-2基因的表达量于光照3 h后开始逐渐上升,在光照结束后3 h时达到表达高峰;在长日照条件下,于光照6 h后ZmPRR 1-2基因的表达量才开始逐渐上升,且在光照结束时达到表达高峰。研究认为,ZmPRR 1-2基因在玉米开花转化过程中对雄穗发育和雌穗发育的调控功能存在差异,推测ZmPRR 1-2基因可能在玉米生物钟调控中发挥重要作用。

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。

mCry1Ac基因在抗虫转基因玉米Bt799中的表达特征

采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)定量检测转mCry1 Ac基因抗虫玉米Bt799在不同生育期不同植株部位的mCry1Ac蛋白含量。结果显示:mCry1 Ac基因在整个生育期玉米叶、茎、根和种子中均能表达,mCry1Ac蛋白含量为(0.82±0.10)^(15.83±1.77)μg·g-1;随着生育期和植株部位的不同,mCry1Ac蛋白含量呈现明显的时空动态变化,其中,叶、茎和根中mCry1Ac蛋白含量随转基因玉米生育期的推移均呈增加趋势,并均在完熟期达最高;在除苗期外的其他各生育期叶中mCry1Ac蛋白含量均显著高于其他植株部位,而在完熟期种子中mCry1Ac蛋白含量在各植株部位中最低,为(2.86±1.71)μg·g-1。

转cry1 Ac/sck基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落影响的评价

以转cry1Ac/sck双基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4(对照:MH86)及其杂交稻KF6-304(对照:Ⅱ-YM86)为材料,系统地研究了转基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落的影响及生态安全性。结果表明:在群落水平上,转基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304对稻田寄生蜂的物种丰富度、多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数的总体情况与时间动态以及个体总数无明显负面影响,但在生长中期转基因稻可降低稻田寄生蜂的个体数量。按寄生蜂功能团分析,MSA与MSA4在水稻生长发育的后期初始,提高卵寄生蜂的数量,MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304显著降低以靶标害虫稻纵卷叶螟为寄主的寄生蜂功能团的个体数量,对其他寄生蜂无明显负面影响。

转cry1 Ab/cry1 Ac基因籼稻对稻田节肢动物群落影响

将稻田节肢动物群落按营养关系划分为 5个功能团 ,即植食类、寄生类、捕食类、腐食类和其它类 ,从功能团优势度、功能团内科组成及其优势度、群落主要参数及群落相异性等方面 ,经两年四点的调查就 2个转cry1Ab cry1Ac基因籼稻(Bt水稻 )品系TT9 3和TT9 4对稻田节肢动物群落的影响作了较系统评价。植食类、寄生类和腐食类功能团内某些优势科的优势度在Bt水稻田与对照 (IR72 )田之间有时呈显著或极显著差异 ,如Bt水稻田中茧蜂或姬蜂科的优势度有时明显低于对照。但是 ,在大多情况下Bt水稻田与对照田之间功能团优势度、功能团内科组成及其优势度、群落主要参数 (物种丰富度、Shannon Wiener多样性指数、均匀性指数、优势集中性指数 )及其时间动态基本无明显差异 ;Bt水稻田与对照田间植食类、寄生类、捕食类亚群落和整个节肢动物群落的相异性大多较低。可见 。

外源ABA对低温胁迫下玉米幼苗内源激素含量及Asr1基因表达的调节

脱落酸(ABA)是低温逆境下的重要信号因子,为了探讨外源ABA对低温胁迫下玉米幼苗的生长调节作用,以耐低温玉米品种久龙5号为试验材料,采用不同浓度(5、15、25、35 mg L–1)ABA于玉米三叶一心时喷雾于叶片,并进行低温梯次处理。分析处理后玉米叶片相对电导率、抗氧化酶活性及内源激素ABA、IAA的含量变化,并采用Real-time PCR明确Asr1基因表达水平变化。结果表明,低温胁迫下不同浓度外源ABA处理的玉米叶片相对电导率整体呈上升趋势,SOD和POD活性加强,15 mg L–1和25 mg L–1ABA处理的SOD活性均显著高于未应用ABA处理,玉米內源ABA和IAA合成水平上升,应用ABA后Asr1基因相对表达水平上调,其中5、15和25 mg L–1浓度处理基因表达上调显著。相关分析表明,ABA含量与Asrl基因相对表达量、SOD活性均表现为极显著正相关,与POD活性显著正相关。说明Asr1基因表达受ABA的介导调控,Asr1基因表达量的提升,也促进了内源ABA的合成,抗氧化酶活性加强,提升了应用ABA后玉米的抗低温能力。但外源ABA的介导调控具有一定浓度效应,表现为低促高抑。

农杆菌介导Cry1Ac基因转化菊花

用农杆菌介导法,以茎段(节间)为外植体,将含有苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白Cry1Ac基 因的植物遗传载体导入菊花(切花菊)品种‘日本黄’中,得到126株抗性植株,PCR检测及基因组DNA 的Southern杂交分析表明Cry1Ac基因已整合到菊花总DNA中,共获得6株转基因植株。利用棉铃虫做转基 因植株的盆栽和叶片平皿试验,发现其中2株对棉铃虫具有很高抗性,校正死亡率达90%以上;1株对棉 铃虫具有高抗性,校正死亡率达80%以上;3株对棉铃虫抗性较明显,校正死亡率44.7%～60.9%。

转修饰cry1 Ac基因籼稻明恢81经花药培养获得抗虫DH系

对基因枪法获得的明恢 81转修饰的cry1Ac基因当代植株进行花药培养 ,共接种花药 2 6 0 0枚 ,获得 83份花培植株 ,其中双倍体植株 43份 ,单倍体植株 40份。PCR结果表明含有cry1Ac基因的植株 5 5份 ,花培植株群体中转基因与非转基因植株的比值为 2∶1(5 5 2 8)。进一步结合Southernblot和ELISA分析 ,于花培植株当代筛选到转基因纯合株系 36份。外源蛋白表达量上 ,花药来源于同一克隆的DH系的不同植株之间基本一致 ,最高的Cry1Ac含量达 0 2 5 %。田间抗虫性试验表明 ,经花药培养纯合获得的部分转基因纯合系植株对二化螟 (Chilosuppressalis)表现出高抗 ,而且主要农艺性状保持不变。以上结果表明水稻花药培养可以加速转基因的纯合与育种利用。

农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。