Cry1Ac毒蛋白质对亚洲玉米螟幼虫几种酶活性的影响

为探索Cry1Ac毒蛋白质与亚洲玉米螟[Ostrinia furnacalis(Güenée)]体内解毒酶间的关系及Cry1Ac作用下保护酶间的平衡关系,室内配制不同Cry1Ac毒蛋白质含量(200 ng/g、500 ng/g、800 ng/g、1 100 ng/g)的人工饲料饲喂亚洲玉米螟幼虫,用分光光度法测定了3龄和5龄幼虫体内乙酰胆碱酯酶、α-乙酸萘酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。结果表明:1 100 ng/g毒蛋白质处理的3龄幼虫乙酰胆碱酯酶活性显著高于对照和其他处理,800 ng/g处理的该酶活性显著高于200 ng/g处理,1 100 ng/g毒蛋白质处理的5龄幼虫的该酶活性显著高于200 ng/g处理。1 100 ng/g处理3、5龄幼虫的α-乙酸萘酯酶活性均显著低于对照和其他处理,800 ng/g处理的3龄幼虫该酶活性显著低于对照和200 ng/g处理,500 ng/g处理的该酶活性显著低于200 ng/g处理。1 100 ng/g、800 ng/g、500 ng/g处理的3龄幼虫羧酸酯酶活性显著低于对照,1 100 ng/g处理的5龄幼虫该酶活性显著低于对照和200 ng/g处理。1 100 ng/g、800 ng/g、500 ng/g处理的3龄幼虫谷胱甘肽转移酶活性显著低于200 ng/g处理,1 100 ng/g处理的5龄幼虫该酶活性显著低于对照。500 ng/g、800 ng/g处理3龄幼虫的超氧化物歧化酶活性显著高于对照。500 ng/g、800 ng/g、1 100 ng/g处理的3龄幼虫过氧化氢酶活性显著低于对照,800 ng/g、1 100 ng/g处理的该酶活性显著低于200 ng/g处理,1 100 ng/g处理的5龄幼虫该酶活性显著低于对照和200 ng/g处理。可见,不同含量Cry1Ac毒蛋白质处理的亚洲玉米螟体内,除5龄幼虫超氧化物歧化酶外,其他酶的活性在处理间均有显著变化。

甲型流感病毒多功能蛋白质NS1的研究进展

近年来大量的研究结果表明,甲型流感病毒的非结构蛋白质1(NS1)是在感染病毒期间具有多个辅助功能的毒力因子,为揭示该人畜共患病毒的致病性机理提供重要参考价值。这篇文章综述了该病毒蛋白质一些最新研究进展,包括NS1的合成、结构、亚细胞定位及在病毒复制机制、宿主天然免疫应答或/和适应性免疫应答、细胞信号传导中发挥各种作用。作者重点阐述了NS1-RNA之间和NS1-蛋白质之间的相互作用,因为它们都是上述功能和过程的基础。同时突出不同毒株NS1蛋白可能特有的特性,鉴于此,也讨论了NS1对人和动物甲型流感病毒致病性的某些作用。最后概述NS1可能应用于流感疫苗的研制、新抗病毒药物的研发等。同时比较了乙、丙型流感病毒NS1研究新进展。

抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定

利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体单链抗体。从最后一轮筛选中随机挑取单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得8个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。挑取阳性值最高的scFv(1E2)建立了基于单链抗体的Cry1B毒蛋白质间接竞争ELISA检测方法。结果表明,Cry1B毒蛋白质对噬菌体scFv(1E2)的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/ml,最低检测限(IC10)为0.013 4μg/ml,线性检测范围在0.5μg/ml至4.0μg/ml之间。

枯草芽孢杆菌粗酶液对Cry1Ac蛋白质的降解特性

为了明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)粗酶液对Cry1Ac毒蛋白质的降解特征,采用蛋白质凝胶电泳[十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)]和酶联免疫吸附法(ELISA),在不同温度和pH值条件下测定该菌粗酶液降解Cry1Ac蛋白质的特性。结果表明,枯草芽孢杆菌主要以胞外酶液降解Cry1Ac蛋白质,胞外粗酶液在40℃、pH值为10的条件下对Cry1Ac蛋白质的降解效果最佳,粗酶液S1对Cry1Ac蛋白质降解的米氏常数(Km)为2.0994μg/L,最大反应速度(Vmax)为0.23958μg/(L·min)。在降解45min时,Cry1Ac蛋白质含量由4.987μg/L降至0.159μg/L,其降解程度达极显著水平(P<0.01),其降解率为96.815%。枯草芽孢杆菌的胞外酶液主要发挥降解Cry1Ac蛋白质的作用,其粗酶液对Cry1Ac蛋白质的降解最适条件为40℃、pH值为10以及Km为2.0994μg/L。

Cry1Ac毒蛋白对粘虫生长发育、繁殖及飞行能力的影响

为了更全面地评价转基因作物对粘虫Mythimna separata(Walker)(鳞翅目:夜蛾科)的影响,在室内用生测法研究了粘虫初孵幼虫连续取食含不同浓度的Cry1Ac毒蛋白的人工饲料后,其生长发育、繁殖及飞行能力的变化。结果表明:取食0(对照),3,6,12,24,48和96μg/gCry1Ac毒蛋白人工饲料6d后的幼虫头宽、体长、18d后的体重随着毒蛋白浓度的升高显著降低,幼虫发育历期显著延长,死亡率显著升高。取食含毒蛋白浓度>12μg/g饲料的幼虫不能正常化蛹;取食含0,3和6μg/g毒蛋白饲料的幼虫能正常化蛹、羽化,化蛹率随着毒蛋白浓度的升高而显著降低、蛹历期显著延长;取食含0,3和6μg/g毒蛋白饲料的幼虫羽化的成虫繁殖能力有显著差异,产卵前期随毒蛋白浓度的升高显著延长,产卵量显著降低;而1日龄成虫飞行能力(飞行距离、时间和速度)则随毒蛋白浓度的升高显著降低。这些结果表明,Cry1Ac毒蛋白对粘虫的生长发育、繁殖及飞行具有显著影响,从而为完善转Bt作物的生态安全性风险评估提供了重要的实验依据。

棉铃虫中肠特异性结合蛋白ABCC1对Cry1Ac毒力的影响

【目的】研究棉铃虫(Helicoverpa armigera)中肠蛋白ABCC1(HaABCC1)与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系(96S)和Cry1Ac抗性品系(BtR)棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系(BtR)与敏感品系(96S)棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。

Cry1Fa对Cry1Ac抗性棉铃虫的毒力评价

为了防治多种鳞翅目害虫,表达Cry1Fa的转基因玉米和棉花已在美国商业化种植。明确棉铃虫Helicoverpa armigera对Cry1Fa与Cry1Ac的交互抗性及这两种杀虫蛋白之间的协同作用,可以为表达Cry1Fa+Cry1Ac的转双价抗虫棉花的合理应用提供依据。本实验测定了Cry1Fa对棉铃虫敏感品系(96S)及用Cry1Ac筛选的抗性品系(BtR,抗性倍数2194.15倍)的毒力,发现Cry1Fa对敏感棉铃虫的毒力远低于Cry1Ac,LC50值是Cry1Ac的504.80倍;而且抗性品系BtR对Cry1Fa存在19.98倍的交互抗性。Cry1Fa与Cry1Ac混用可以提高Cry1Fa毒杀敏感棉铃虫的效果,尤其是Cry1Fa浓度较低时,加入Cry1Ac,可以显著增加Cry1Fa的毒力;但只有加入较高浓度的Cry1Fa时才能增加Cry1Ac的毒力。由于BtR品系已经对Cry1Ac产生抗性,Cry1Ac对抗性棉铃虫的毒力明显降低;在较高浓度的Cry1Ac中加入Cry1Fa可以显著增加棉铃虫的死亡率(P=0.0015,F=6.88,df=6),但最高死亡率仅为58.33%。D-饱和最优试验的结果证实,Cry1Ac对于敏感棉铃虫的死亡率的影响达到显著水平(t1=13.76﹥t0.05),Cry1Ac与Cry1Fa的交互作用对毒力的影响也达到显著水平(t22=2.42﹥t0.05;t11=6.95﹥t0.05;t12=3.43﹥t0.05)。Cry1Ac和Cry1Fa对抗性棉铃虫死亡率的影响都达到显著水平(t1=3.03﹥t0.05;t2=2.59﹥t0.05),但Cry1Ac是决定抗、感棉铃虫死亡率的关键因素;Cry1Ac与Cry1Fa最佳浓度配比范围都是1.41～2.10μg/cm2;在抗性品系中,Cry1Ac和Cry1Fa的交互作用不显著。所以,尽管Cry1F+Cry1A作物扩大了杀虫谱,但棉铃虫对这两种蛋白存在交互抗性,而且这两种蛋白混用对治理抗Cry1Ac棉铃虫的效果不理想,因此不建议在中国种植表达Cry1F+Cry1A的棉花。

苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因在虫生真菌球孢白僵菌中的表达

依据苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因序列设计引物进行PCR扩增,纯化产物与载体pbarGPE1连接,构建真菌表达载体pBARGPE1-Cry1Ac,通过芽生孢子转化法转入野生型球孢白僵菌中,获得多拷贝转化子;毒力测定结果表明转化子对马尾松毛虫的LC25比出发株降低5.4倍,LD25减少7.1倍,LT25缩短2.2 d,毒力明显提高;喂食处理和虫体喷雾喂食结合处理与单纯虫体喷雾处理相比,累计致死率分别提高了55.6%和63.0%,致死中时分别缩短了4.5 d和5.3 d。结果表明,苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因的表达显著提高了球孢白僵菌的毒力。这是Cry1Ac基因首次在虫生真菌中表达。

转sck/cry1Ac基因稻谷对米蛾幼虫解毒酶系的影响

采用酶活力测定及酯酶同工酶电泳方法研究米蛾(Corcyra cephalonica)幼虫取食表达SCK/Cry1Ac毒蛋白的转基因稻谷后体内重要解毒酶活力的变化,明确其代谢毒蛋白的主要酶类。结果表明:取食转Bt基因稻谷米蛾幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、碱性磷酸酯酶的活力在24～72h显著低于对照;酸性磷酸酯酶活力在12、48h和72h时也显著低于对照;而α-乙酸萘酯羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活力显著高于对照。谷胱甘肽-S-转移酶的活性除饲喂24h的处理外,其他处理与对照无显著差异。此外处理72h后米蛾幼虫体内酯酶同工酶谱有4条酯酶酶带,4种酯酶Est1、Est2、Est3、Est4的活性均受到不同程度的抑制,酯酶Est4的抑制效果最明显。这些解毒酶和酯酶同工酶直接参与Bt毒蛋白的代谢作用。

不同光质LED光源对转基因杨树叶片Bt毒蛋白含量及叶绿素荧光参数的影响

为探明不同光质对杨树幼苗生长的影响,以转基因741杨株系Pb29为试材,利用LED精量调制光源,设置红光、蓝光、红蓝光、白光4个处理,测定不同光质处理下Pb29的Cry1Ac毒蛋白含量、形态指标、光合色素含量及叶绿素荧光参数。结果表明,蓝光处理下的Cry1Ac毒蛋白的表达量最大,白光次之。除了叶片长/宽的值在蓝光处理下最大外,红蓝光处理下的741杨叶片数、叶片长、叶片宽、叶面积及株高均高于其它处理。除叶绿素b的含量在红光处理下最大外,叶绿素a、叶绿素a+b、类胡萝卜素含量及叶绿素a/b比值均在白光处理下最大,红蓝光次之,且白光与红蓝光间无显著差异。叶绿素荧光参数(ΦPSⅡ、ETR、q P)在蓝光和红蓝光处理下高于其它处理,在白光和红蓝光处理下的Fv/Fm高于其它处理,q N在红光处理下最大。由此可知,不同光质对杨树幼苗的生长具有调控作用。本试验结果为深入研究不同光质对杨树的生长发育进行调控提供了科学依据。

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zea mays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的Cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因,构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体,表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白.用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中,轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选,获得可育的再生植株.经PCR及Southern blot分子检测,证实所获得的再生植株为转基因植株.抗虫性分析结果表明,部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性.

昼夜变温下高温与干旱胁迫对Bt棉毒蛋白含量的影响及其生理机制

【目的】明确Bt棉叶片Cry1Ac毒蛋白含量对昼夜变温下高温干旱胁迫响应及其生理机制,为生产中Bt棉抗虫性的安全稳定利用提供参考。【方法】2019—2020年在扬州大学农学院,以常规种泗抗1号(SK-1)和杂交种泗抗3号(SK-3)为材料,以温度和土壤水分含量为因子,温度分别设为34℃(白天,7:00—19:00)/28℃(夜间,19:00—7:00)(A1)、38℃/28℃(A2);土壤水分含量分别为田间土壤最大持水量的50%(B1)和60%(B2),并以32℃/28℃、田间土壤最大持水量的75%为对照(CK)。各处理分别持续4、7、10 d(DAS)。【结果】不同处理导致叶片中Cry1Ac毒蛋白含量降低,且随着胁迫时间的延长,下降幅度增加。处理间相比,A1B2处理下降幅度最少,7 DAS后开始显著低于CK;A1B1处理下降幅度其次,4 DAS后显著低于CK;A2B1、A2B2处理在4 DAS显著下降。可溶性蛋白(SP)含量、硝酸还原酶(NR)、谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酰胺合成酶(GS)、游离氨基酸(aa)和谷氨酸合成酶(GOGAT)等活性变化趋势与毒蛋白一致,且呈极显著正相关,而Bt基因表达量、单宁含量、蛋白酶、肽酶活性则呈上升趋势。逐步回归和通径分析筛选出NR、GPT、GS等3个关键指标可反映Bt棉Cry1Ac毒蛋白含量高低,且三者对Cry1Ac毒蛋白含量有较大的正效应。【结论】昼夜变温下高温和干旱互作导致Bt棉Cry1Ac毒蛋白含量降低,且随持续期延长下降幅度逐渐增大。其中34℃/28℃和田间土壤最大持水量60%胁迫7—10 d内与对照无显著差异。但与昼夜持续高温相比,昼夜变温的高温胁迫下Cry1Ac毒蛋白含量下降幅度减小和时期明显推迟。NR、GPT、GS是决定Cry1Ac毒蛋白含量高低的关键指标。

Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟生长发育和种群增长的影响

以含不同浓度的Cry1Ac毒蛋白的人工饲料(不加毒蛋白为对照)饲喂亚洲玉米螟幼虫,采用实验种群生命表的方法,测定了Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟的控害作用。结果显示,含2 000.0ng/g Cry1Ac毒蛋白的人工饲料处理该虫第5天的幼虫存活率为0;200.0、20.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理第10、15天的幼虫存活率、化蛹率、成蛾率、净增长率和种群增长指数均显著低于对照,且高浓度处理显著低于低浓度处理;200.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理的世代平均周期和种群加倍时间显著长于其它处理;而200.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理的周限增长率显著小于2.0、0.2 ng/g处理。表明微量的Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟的种群增长有显著影响,且随着浓度的增加控制作用增强。

高耐铝红酵母RS1耐铝特性初步研究

红酵母RS1是从酸性土壤中筛选出的一株高耐铝微生物,本文对其耐铝特性进行了初步研究。结果发现,RS1可以在pH 2.5的培养基中生长,50～200 mmol/LAl3+处理对RS1产生了毒害作用,其毒害并未对细胞表面形态产生影响。RS1对Al2(SO4)3的忍耐能力高于AlCl3,这种高的忍耐能力是遗传固有的,并不被诱导产生。此外,RS1可以增加体内蛋白含量来适应高的铝毒,其中蛋白型巯基可能在耐铝中表现重要作用。

Cry1Ac的绿色荧光蛋白GFP标记及其在棉铃虫幼虫中肠的定位分布

为了明确Cry1Ac蛋白在棉铃虫体内与中肠组织的相互作用,采用重叠PCR方法将Bt-cry1Ac基因和绿色荧光蛋白GFP基因融合,构建含Cry1Ac毒蛋白和绿色荧光蛋白GFP原核表达载体,并在大肠杆菌大量表达。利用荧光显微镜观察发现,表达Cry1Ac-GFP融合蛋白的大肠杆菌在蓝光激发下发出绿色荧光。将含有融合蛋白的菌液拌入人工饲料饲喂3龄棉铃虫幼虫96h,取棉铃虫幼虫中肠做冰冻切片并在荧光显微镜下观察。结果显示,取食含有Cry1Ac-GFP融合蛋白饲料的棉铃虫幼虫中肠能够发出强烈荧光。比较Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性棉铃虫幼虫中肠的发光部位,敏感棉铃虫幼虫的中肠围食膜已经消失,肠壁细胞发出强烈的荧光,而抗性棉铃虫的围食膜较健全并发出荧光。

田间多次交配棉铃虫种群对Bt棉的抗性监测

2008年采用改进的F2代法和含毒饲料法监测河北省邱县和山东省无棣县田间棉铃虫（Helicoverpa armig-era）对Bt棉的抗性，结果表明：邱县和无棣县田间棉铃虫雌蛾普遍存在多次交配现象（1次交配率仅占30．0％-38．2％），改进的F2代法估测得这2个多次交配种群对Bt棉的抗性等位基因频率分别为0．0826（0．0311-0．1340）和0．0764（0．0265—0．1263）；含毒饲料法测定这2个地区棉铃虫对CrylAc毒蛋白的抗性分别为20．9倍和12．5倍，达到中等水平抗性。说明2个地区棉铃虫的抗性已处于上升阶段，需尽快采取有效的抗性治理对策。

抗Cry1Ac小菜蛾种群生命表及其适合度研究

本实验研究了小菜蛾Plutella xylostella L.高抗Cry1Ac种群DBM1Ac-R(抗性倍数大于1000)及敏感种群DBM1Ac-S的生长发育、繁殖等生物特征情况,组建了两种群的生命表,并对其适合度进行了研究。结果表明,DBM1Ac-R的产卵量、卵历期、孵化率和化蛹率、蛹重及雌雄比(♀:♂),均显著低于DBM1Ac-S。DBM1Ac-R相对于DBM1Ac-S的相对适合度为0.5762,表明Cry1Ac抗性种群在繁殖能力上存在明显的生存劣势。