农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究

【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高粱品种"BABUSH"和"MN-3025"中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦(Bialaphos)梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng.g-1叶片鲜重(FW),最低的仅为1.93 ng.g-1叶片鲜重(FW),平均为87.50 ng.g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。

转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对亚洲玉米螟、棉铃虫和黏虫的抗性评价

利用农杆菌介导法将Bt cry1Ah基因转入玉米自交系综31,获得对玉米螟有显著抗性的转基因玉米HGK60,为了研究其对鳞翅目害虫的杀虫活性,在室内和田间分别用亚洲玉米螟、棉铃虫和黏虫幼虫对HGK60玉米的杀虫效果进行检测。室内生物活性检测结果表明,取食HGK60玉米心叶的亚洲玉米螟幼虫在3 d后死亡率达100%;HGK60玉米对棉铃虫幼虫有毒杀作用,玉米不同部位对棉铃虫幼虫的杀虫效果存在差异;与非转基因玉米对照相比,取食HGK60玉米叶片一周后的黏虫幼虫体重增长明显受到抑制。田间生物活性检测结果表明,HGK60玉米对于亚洲玉米螟和棉铃虫有很强的杀虫活性,达到高抗级别,对于黏虫有一定的杀虫活性,为抗性级别。

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。

利用密码子优化提高Bt cry1Ah基因在转基因玉米(Zea mays L.)中的表达

Bt cry1Ah基因是本实验室从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中克隆的一种新型杀虫蛋白基因。在前期工作中已根据植物密码子偏好性对cry1Ah基因进行过一次优化。根据玉米密码子偏好性对cry1Ah基因进行第二次优化,并将两次优化的cry1Ah基因分别构建了pAhmG和pmAhb植物表达载体,利用农杆菌介导法转化玉米自交系综31,分别得到10株和9株阳性转基因玉米植株。通过ELISA、Westernblot检测及生物活性检测,比较不同优化的基因在玉米中的蛋白表达量及抗虫情况。初步结果表明外源基因在玉米植株中可以稳定表达并可以遗传。二次优化基因比一次优化基因在玉米中的蛋白表达量更高,抗虫性更好。表明密码子优化有利于提高外源基因的表达。

Cry1Ah蛋白活性片段在溶液中的单体和寡聚体杀虫活性分析

[目的]分析NaCl对寡聚化的影响,以及寡聚化对Cry1Ah杀虫活性的影响。[方法]利用Superdex-75分子筛,将Cry1Ah活性片段的寡聚体和单体进行分离,通过戊二醛交联试验分析寡聚化程度,结合生物活性测定,分析NaCl对寡聚化的影响以及寡聚化对Cry1Ah毒力的影响。[结果]在纯化的组分峰Ⅰ中寡聚体占总蛋白的63.35%。NaCl对寡聚化有促进作用,而寡聚体又以多种形式存在,并且表现出不同的生物活性。寡聚体峰Ⅰ、寡聚体峰Ⅱ、单体峰Ⅲ对棉铃虫的LC50分别为47.192、3.329、3.977μg/mL。[结论]NaCl对寡聚化有促进作用,而且,寡聚体的毒力比Cry1Ah活性片段的毒力有不同程度的降低,最多下降49.6倍。推测这种体外形成的寡聚体不同于昆虫体内形成的寡聚体,引起插膜穿孔能力下降,导致毒力不同。

转cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫生长发育和成虫移动能力的影响

本文利用花粉饲喂法研究了转cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫Propylea japonica生长发育及成虫移动能力的影响。结果显示,与混有适量蚜虫的非转基因亲本对照玉米花粉(花粉与蚜虫重量比为2:1)相比,龟纹瓢虫幼虫取食混有适量蚜虫的转cry1Ah基因玉米花粉(花粉与蚜虫重量比为2:1)后,幼虫总发育历期、蛹期和成虫寿命均无显著差异,但1、3和4龄幼虫的发育历期显著高于对照,2龄幼虫的发育历期显著低于对照;2龄和4龄幼虫的存活率与对照无显著差异,但3龄幼虫的存活率显著增加;幼虫取食Bt花粉对该虫的蛹重、羽化率和雌雄比与对照无显著差异。幼虫期取食Bt玉米花粉而成虫期取食蚜虫对成虫的日产卵量无不利影响,与对照无显著差异。幼虫取食Bt玉米花粉羽化后雄虫和雌虫的步速和翻跃时间与对照均无显著差异。

Cry1Ah蛋白通过三级食物链对龟纹瓢虫幼虫的影响

使用生物测定方法评价了Cry1Ah蛋白和食料对龟纹瓢虫幼虫的影响。研究结果表明,用1.0和10.0μg.g-1的Cry1Ah蛋白处理下的棉铃虫饲喂龟纹瓢虫后,其存活率、幼虫虫体质量、幼虫发育时间和化蛹率均没有影响,但龟纹瓢虫体内某些酶活力有所改变,这种改变并未显著影响幼虫的生长发育。用蚜虫饲喂的龟纹瓢虫存活率、虫体质量和化蛹率显著高于棉铃虫处理,差异达显著水平;幼虫发育时间前者显著短于后者。研究结果表明食料的不同对龟纹瓢虫的影响远远大于Cry1Ah蛋白对其的影响。

Cry1Ah蛋白对多异瓢虫和日本通草蛉的安全性评价

非靶标生物在转基因抗虫作物的环境安全性评价中具有非常重要的地位。本研究系统评估了新型Bt杀虫蛋白Cry1Ah对多异瓢虫幼虫、成虫和日本通草蛉成虫各项生物学指标的影响。结果表明,取食体表布满Cry1Ah蛋白的桃蚜后,多异瓢虫幼虫存活率、幼虫历期、蛹历期、体质量、雌雄成虫寿命、雌虫产卵量与对照相比均差异不显著。日本通草蛉成虫取食含有Cry1Ah蛋白的蜂蜜水后,雌雄成虫寿命、雌虫产卵量与对照间均差异不显著。因此,Cry1Ah蛋白对多异瓢虫和日本通草蛉的各项生命指标无显著的不利影响,这为转Cry1Ah基因抗虫棉花商业化释放前的安全性评价提供重要的技术支撑。

Cry1Ab/Cry1Ah杂合蛋白构建与功能研究

Cry1A类杀虫蛋白是目前应用最为广泛的杀虫蛋白,目前已经报道的Cry1A类杀虫蛋白之间存在普遍的结构域交换现象。针对鳞翅目害虫具有高活性的Cry1Ab与Cry1Ah蛋白开展研究,构建了Cry1Ab、Cry1Ah的杂合蛋白AhAhAb并测定了杀虫活性。结果显示,Cry1Ab、Cry1Ah的结构域交换引起蛋白杀虫活性的显著变化,与出发蛋白相比,杂合蛋白AhAhAb丧失了对棉铃虫杀虫活性,降低了对玉米螟、小菜蛾杀虫活性。利用生物信息学方法对Cry1Ah结构域I建模,并分析其与其他Cry1A蛋白结构及表面性质差异,分析表明Cry1Ah与Cry1Ab的结构域I有相同的碳骨架和二级结构,但是表面电势分布有较大差异。进一步分析杂合蛋白AhAhAb与Cry1Ab、Cry1Ah之间杀虫活性差异的原因对进一步揭示Cry1A类蛋白杀虫特异性进化规律有重要意义。

利用ubi1内含子增强Bt cry1Ah基因在转基因玉米中的表达

Bt cry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌分离株BT8中鉴定克隆的新型杀虫蛋白基因.本研究构建了两个含有Bt cry1Ah基因的植物表达载体,在其中一个植物表达载体(pUUOAH)的玉米Ubiquitin启动子与cry1Ah基因之间插入了玉米泛素蛋白基因ubiqutin1的第一个内含子(ubi1).利用基因枪法将其导入玉米(ZeamaysL.)胚性愈伤组织中,得到了可育的再生植株.PCR及Southern blot检测结果表明,cry1Ah基因已整合入玉米基因组中,并稳定遗传至下一代.对T1及T2代转基因植株进行ELISA检测,发现pUUOAH载体转基因植株Cry1Ah蛋白的平均表达量提高了20%.对T2代转基因植株进行了田间抗虫性鉴定,发现转cry1Ah基因玉米对玉米螟有很高的抗性,并且pUUOAH载体转基因植株的抗虫性好于pUOAH(无内含子)载体的转基因植株.以上结果表明,玉米ubi1内含子可以有效增强cry1Ah在转基因玉米中的表达。

转Bt-cry1Ah基因玉米花粉对意大利蜜蜂幼虫的影响

新型杀虫蛋白基因cry1Ah基因是中国农业科学院植物保护研究所从Bt菌株BT8中鉴定克隆的,其编码蛋白对鳞翅目害虫具有强毒力,尤其对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)的毒力强于目前使用的cry1A类基因。转cry1Ah基因抗虫玉米具有很好的应用前景。花粉是蜜蜂重要的食物来源,蜜蜂是转基因植物安全性评价的关键测试生物。因此,开展转cry1Ah基因玉米对蜜蜂的安全性研究很有必要。给意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica Spinola蜂群中4～6日龄幼虫饲喂转基因玉米花粉、常规玉米花粉、杂花粉,哺育蜂饲喂为对照。转基因玉米花粉对意大利蜜蜂封盖率、出房率和发育历期没有显著影响。表明转cry1Ah基因玉米花粉对意大利蜜蜂幼虫的存活和发育没有不良影响。

Cry1Ah蛋白标准物质候选物的制备与纯化（英文）

随着转基因技术的迅猛发展,转基因产品的安全性受到了广泛关注。转基因检测用有证标准物质在确保转基因产品定性、定量检测结果的可比性和可追溯性方面发挥着重要作用。但转基因蛋白质标准物质的开发相对缓慢,其中一个难点是制备高纯度的转基因蛋白质候选物。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis cry1Ah1基因因其对亚洲玉米螟等鳞翅目害虫有很好的杀虫活性,已用于转基因抗虫作物的研制,并获得具有较好抗虫性状的转基因株系。为了研发Cry1Ah蛋白有证标准物质,亟需建立其制备及纯化体系。文中优化了利用Bt表达系统制备Cry1Ah蛋白的体系,利用离子交换色谱法和排阻色谱法逐级纯化的方法,获得了高纯度的Cry1Ah蛋白(排阻色谱纯度:99.6%)。生物活性测定结果表明,纯化的Cry1Ah蛋白与原毒素对小菜蛾Plutella xylostella的杀虫活性没有显著差异。最后使用Edman降解法和质谱法确定了Cry1Ah蛋白活化后的氨基酸序列。综上所述,获得的Cry1Ah纯蛋白可用于蛋白质标准物质的研制。

Ubi1 intron-mediated enhancement of the expression of Bt cry1Ah gene in transgenic maize (Zea mays L.)

The cry1Ah gene was one of novel insecticidal genes cloned from Bacillus thuringiensis isolate BT8. Two plant expression vectors containing cry1Ah gene were constructed. The first intron of maize ubiqutin1 gene was inserted between the maize Ubiquitin promoter and cry1Ah gene in one of the plant expressing vectors (pUUOAH). The two vectors were introduced into maize immature embryonic calli by microprojectile bombardment, and the reproductively plants were acquired. PCR and Southern blot analysis showed that foreign genes had been integrated into maize genome and inherited to the next generation stably. The ELISA assay to T1 and T2 generation plants showed that the expression of Cry1Ah protein in the construct containing the ubi1 intron (pUUOAH) was 20% higher than that of the intronless construct (pUOAH). Bioassay results showed that the transgenic maize harboring cry1Ah gene had high resistance to the Asian corn borers and the insecticidal activity of the transgenic maize containing the ubi1 intron was higher than that of the intronless construct. These results indicated that the maize ubi1 intron can enhance the expression of the Bt cry1Ah gene in transgenic maize

转基因玉米HGK60在不同遗传背景下抗虫性鉴定及农艺性状分析

为研究转基因玉米HGK60在不同遗传背景下遗传稳定性和抗虫效果,利用转Bt cry1Ah基因的转基因玉米HGK60为供体,通过回交转育的方式将cry1Ah基因分别导入玉米自交系郑58、昌7-2、lx05-4、lx03-2,获得转基因玉米自交系HGK60-郑58、HGK60-昌7-2、HGK60-lx03-2、HGK60-lx05-4,并杂交获得HGK60-郑单958(HGK60-郑58×HGK60-昌7-2)和HGK60-鲁单9066(HGK60-lx05-4×HGK60-lx03-2),转化体特异性PCR证明cry1Ah基因已转入不同遗传背景玉米中,ELISA检测不同遗传背景转基因玉米叶片中Cry1Ah蛋白表达情况,结果表明在不同遗传背景玉米自交系和杂交种中Cry1Ah蛋白表达没有显著差异;田间人工接虫和室内玉米螟抗虫性鉴定结果表明,不同遗传背景的转基因玉米高抗玉米螟,室内接虫后4 d幼虫死亡率达到100%;对不同遗传背景转基因玉米HGK60进行农艺性状分析,结果显示与受体对照玉米相比,两者之间农艺性状没有显著差异,转基因玉米HGK60可用于抗虫玉米品种的选育。

转Bt基因抗虫玉米HGK60的农艺性状分析

为了确定转Bt cry1Ah抗虫玉米HGK60的自交系及其杂交后代外源基因的遗传表达稳定性和农艺性状,通过实时荧光定量PCR和ELISA分析外源基因的遗传表达稳定性,通过室内外生测和田间性状考量分析农艺性状。荧光定量PCR结果表明Bt cry1Ah基因在玉米的不同组织中可以正常转录,但RNA表达水平存在一定的差异;ELISA结果表明在转基因植株的不同发育时期、不同器官中Cry1Ah的蛋白表达量顺序:雄穗>叶片>苞叶>籽粒>花丝>穗轴。两地连续三代的田间及室内抗虫性检测结果表明HGK60抗虫玉米对亚洲玉米螟均表现出很好的抗性。性状考量结果表明HGK60抗虫玉米与受体材料对照比较,种子发芽率、生育期、穗行数、穗长、千粒重等农艺性状均无显著差异。通过多年多点田间试验和分子检测结果证明HGK60转基因抗虫玉米中外源基因稳定的遗传和表达,对亚洲玉米螟有很好的抗性,农艺性状与对照材料无显著差异。HGK60转基因抗虫玉米对亚洲玉米螟的良好抗性使其具有很好的产业化应用前景。

抗虫/耐草甘膦双价融合基因表达载体的构建及烟草转化

随着植物基因工程的发展,将多个基因转化植株已成为研究的热点之一,利用连接肽进行多个基因融合的策略已引起广泛关注。利用连接多肽2A和LP4/2A分别将抗虫基因Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)cry1Ah和耐草甘膦基因mG2-epsps连接起来,构建了4个融合基因表达载体pHAG、pHLAG、pGAH、pGLAH和两个单基因载体pSAh、pSmG2,其中pHAG、pHLAG是Bt cry1Ah基因在前,mG2-epsps基因在后,pGAH、pGLAH是mG2-epsps基因在前,Bt cry1Ah基因在后,分别用2A和LP4/2A作为连接肽,由CaMV35S启动子驱动。利用农杆菌介导法将6个植物表达载体转入烟草,得到再生植株529株。经PCR检测,有261株再生苗为阳性植株,转化率达到49.3%。获得的转基因烟草可用于分析连接肽2A和LP4/2A的剪切效率以及不同基因与连接肽连接位置差异对基因表达的影响。

一株含cry新基因的苏云金杆菌菌株的研究

苏云金杆菌XPZ-9菌株是从土壤中分离的对鳞翅目幼虫有特异杀虫活性的新菌株。光学显微镜下观察到该菌株可产生菱形和圆形伴胞晶体,SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为70 kDa。PCR-RFLP分析结果表明该菌株含有新基因cry1Ah。生物活性测定表明该菌株对鳞翅目害虫棉铃虫、小菜蛾、亚洲玉米螟和美国白蛾的二龄幼虫都具有较强的杀虫活性。