大豆胚尖转化体系优化和cry1C*基因转化大豆的研究

以抗大豆食心虫品系东农8004的胚尖为外植体,通过对芽诱导和芽伸长培养基进行优化,建立8004的胚尖转化体系,利用该体系进行cry1C*基因的转化,对获得的抗性再生植株进行分子鉴定和抗虫性鉴定。结果表明:在芽诱导培养基中附加1.67 mg·L-16-BA,丛生芽诱导率最高,达到80%,在芽伸长培养基中附加0.5 mg·L-1GA3和0.1mg·L-1IAA,芽伸长率最高为54%。共获得94株PPT(100μg·m L-1)抗性再生植株,PCR检测阳性14株,阳性率为14.89%。对4株T0代阳性植株进行大豆食心虫抗性鉴定,其中C-1植株的食心虫抗性明显高于野生型8004,说明在大豆中表达cry1C*基因能提高大豆对食心虫的抗性。

转Cry1C*基因抗虫水稻的培育

水稻害虫是影响吉林省水稻产量的主要限制因素,为培育抗虫转基因水稻新品种,本研究采用农杆菌介导的遗传转化法,将人工合成的Cry1C*基因导入吉林省主栽粳稻品种吉粳88和吉利518中,共获得410个独立转化株。通过对转基因植株PCR检测,阳性率为67.2%;ELISA检测结果表明:不同株系Bt毒蛋白含量变化较大,变幅为0.40～4.86μg/g鲜叶重;田间抗性鉴定结果表明:2个株系表现高度抗性,且农艺性状与原品种没有显著差异。这两个高抗转基因水稻株系的获得,为进一步培育适宜于吉林省抗虫转基因新品种奠定了基础。

抗虫基因Cry1C*重组表达载体的构建与鉴定

为水稻害虫生物防治提供菌株,从GenBank中选定Cry1C类抗虫基因,将其优化改造后命名为Cry1C*,Cry1C*经BamH I和Spe I双酶切后与植物表达载体pTCK303连接,构建pTCK303-Cry1C*重组表达载体,将其转化到农杆菌LBA4404中,同时进行PCR、双酶切及测序鉴定。结果表明:PCR、双酶切及测序产物与预期扩增片段(2 342bp)相符,重组表达载体pTCK303-Cry1C*构建成功;农杆菌LBA4404中含有重组质粒,成功构建了Cry1C*农杆菌基因工程菌株。

转基因抗虫水稻HD1不同生长发育阶段cry1C*基因表达量

以水稻‘空育131’为受体,利用根瘤农杆菌介导法,创制了转cry1C*基因的抗虫水稻HD1-1等独立系。为了研究水稻HD1-1等在田间生长发育过程中cry1C*基因表达量及糙米Bt蛋白含量,将水稻HD1-1等独立系种植在田间,利用RT-qPCR方法检测分蘖期、抽穗期和灌浆期叶片、茎鞘及幼穗的cry1C*基因mRNA表达量,同时利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各器官及糙米Bt蛋白含量。分析cry1C*基因表达量不同生长发育阶段间的关系,分析糙米Bt蛋白含量与生长发育时cry1C*基因表达量的关系。结果显示,不同水稻独立系cry1C*基因表达量及糙米Bt蛋白含量明显不同,叶片、茎鞘及幼穗中cry1C*基因表达量不同生长发育阶段间往往呈正相关,cry1C*基因mRNA表达量和对应的Bt蛋白含量呈极显著的正相关,糙米Bt蛋白含量和各生长发育阶段各器官cry1C*基因表达量存在正相关趋势。水稻HD1 cry1C*基因表达量在不同生长发育阶段间及其和糙米Bt蛋白含量间呈正相关或正相关趋势。cry1C*基因转录水平越高,Bt蛋白含量越高。

间接竞争时间分辨荧光免疫分析法检测稻米中Cry1C毒素

利用免疫新西兰大白兔制备Cry1C毒素多克隆抗体,建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析（CI-TRFIA）方法,用于稻米中Cry1C毒素的残留检测。通过4次免疫,采集Cry1C毒素多克隆抗体血清,并用饱和硫酸铵沉淀和Protein A柱纯化,测定抗体效价;以制备Eu-N1标记的羊抗兔IgG作为检测抗体,建立Cry1C毒素的CI-TRFIA检测方法,并进行抗原类似物的特异性分析和Cry1C毒素在稻米中的添加回收试验。结果表明：获得的多克隆抗体质量浓度为3.86 mg·mL^-1,效价为1∶48 000;建立的CI-TRFIA检测方法,其灵敏度（IC10）为0.074 ng·mL^-1,中抑制浓度（IC50）为60.16 ng·mL^-1,线性检测范围（IC20~IC80）为0.96~1 633.60 ng·mL^-1;对Cry1B、Cry1Ab和Cry1Ac均有一定的交叉反应;添加回收试验的批内、批间回收率为84.53%~107.12%,变异系数为6.05%~11.24%。结论：该检测方法稳定性和重复性较好,可以满足Cry1C毒素的检测要求。

B.thuringiensis穿梭载体的构建及cry1C基因的表达

以pUC19为母体，克隆了Btken－Ag（B.thuringiensissubsp.kenyaeAg）的复制起始区（～1．6kb）和pUC4K的aphⅠ基因，构建成穿梭载体pHV－1。pHV－1在E.coli中经100个世代，质粒保持率在80％以上；5在Bti4Q8（B．thuringiensissubsp.israelensis4Q8）中经40个世代，质粒保持率在80％以上。将B．licheniformis热稳定α－淀粉酶基因启动子控制下的Bt9510（B．thuringiensis9510）的crylC结构基因插入pHV－1，构建成重组质粒pHV－crylC，电激转化导入Bit4Q8。光学显微镜下观察，Bit4Q8无晶体产生；而Bit4Q8（pHV－crylC）则出现典型的菱形晶体，其晶体略小于Bt9510。生物测定结果表明表达的Cry1C蛋白对甜菜夜蛾具有一定的毒杀活性。

转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因整合分析与品系特异性检测

利用染色体步移方法分离获得转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因旁侧序列及其水稻基因组中的插入位点,并建立了吉生粳3号品系特异性PCR检测方法。通过对吉生粳3号外源基因左、右边界旁侧序列分别与水稻基因组序列和T-DNA序列的比对分析确定其插入位点,发现T-DNA在水稻基因组(日本晴)2号染色体上的基因间区2790685-2790589位点(GenBank登记号:NC_029257.1)。根据T-DNA插入位点,在插入位点两侧基因组区域和T-DNA左边界设计特异性引物,建立了吉生粳3号事件特异性PCR检测方法,为吉生粳3号的身份识别提供了准确、快速的检测技术手段。

B.t.c. cry1C全长基因的克隆及其在增产菌中的表达

设计的一对引物 ,对苏云金芽孢杆菌科默尔亚种 (Bacillusthuringiensissubsp .colmeri)1 5A3菌株中的cry1C基因进行PCR扩增 ,得到包括结构基因 ,调节基因在内的全长为4 0kb的PCR产物。经两步克隆 ,将此基因连接至穿梭表达载体pHT31 5上 ,得到重组质粒pHT 1C。通过电转化将其导入一株增产菌蜡状芽孢杆菌 (Bacilluscereus) 95 0 9菌株 ,SDS PAGE检测到 1条 60kD左右的蛋白带 ,镜检观察到菱形晶体 ,生测结果表明 ,cry1C基因的导入使Bc95 0 9菌株获得了对甜菜夜蛾的杀虫活性。

水稻抗虫(Cry1C)和抗稻瘟病(Pi1,Pi2)材料的创制

为了提高抗虫转基因水稻的稻瘟病抗性,利用已育成的以粳稻为遗传背景的抗虫转基因(Cry1C)水稻新品系济抗10号为受体,选择带有广谱高抗稻瘟病基因(Pi1,Pi2)的空育131为供体,通过杂交与多代回交进行抗虫和抗稻瘟病基因的聚合,对每一世代的后代单株通过分子标记辅助选择、田间抗病虫鉴定、田间农艺性状选择,创制出了4个抗虫和抗稻瘟病的新材料SK01、SK02、SK03、SK04,田间均表现出很好的抗虫、抗稻瘟病特性以及优质丰产性状,为黄淮稻区抗病虫水稻育种奠定了基础。

转cry1C~*及cry2A~*基因早粳稻Bt蛋白的时空表达和抗螟虫性

早粳稻空育131为受体,以根瘤农杆菌介导遗传转化法创制了转ubi启动子调控下的cry1C*及cry2A*基因早粳稻空育131 (cry1C*)和空育131(cry2A*)。为了研究转基因水稻Bt蛋白的时空表达特性及抗螟虫性,将不同转化事件形成的转基因早粳稻品系种植于田间,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测转基因水稻不同生长发育阶段不同器官的、以及成熟期糙米的Bt蛋白量,采用室内离体茎秆法接虫鉴定转基因水稻的抗螟虫性。结果显示,转基因早粳稻不同抗虫基因Bt蛋白量不同, cry1C*基因总是低于cry2A*基因的蛋白质表达量;不同生长发育时期Bt蛋白量不同,叶片和茎鞘等器官的Bt蛋白量为分蘖期<抽穗期<灌浆期,幼穗或糙米等器官的Bt蛋白量为抽穗期幼穗>灌浆期幼穗>成熟期糙米;不同器官Bt蛋白量不同,高低次序在分蘖期为叶片、茎鞘,抽穗期为叶片、幼穗和茎鞘,灌浆及成熟期为叶片、茎鞘、幼穗和糙米;同一抗虫基因不同转基因品系间抽穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官Bt蛋白量及抗螟虫性、糙米Bt蛋白量等性状存在差异,抽穗期各器官Bt蛋白量与抗螟虫性及成熟期糙米Bt蛋白量之间相关不显著,不论Bt蛋白量高或低的品系均表现为高抗螟虫。转基因早粳稻营养器官生长发育前期Bt蛋白量较低、后期较高,繁殖器官生长发育早期Bt蛋白量较高、晚期较低,营养器官通常比繁殖器官的Bt蛋白量高。在本研究范围内,不同基因及不同转化事件培育的转基因水稻Bt蛋白表达量高低不同,但所有的转基因早粳稻品系均表现高抗螟虫。

靶向模拟Bt Cry1C蛋白抗虫功能的人源化基因工程抗体筛选及鉴定

Bt蛋白制剂及其转基因作物长时间推广应用,害虫抗药性等问题日益凸显,探索新型安全抗虫材料已成为竞先研究的热点。基于抗体免疫网络学说的抗独特型抗体技术被证实可用于研发抗原生物活性类似物,有望成为靶向创制模拟Bt蛋白抗虫功能材料的新途径。以Bt Cry1C蛋白多克隆抗体为包被抗原,从人源化噬菌体单链抗体库中获得9个阳性单克隆,其中E8-Anti-Id scFv经鉴定为β型抗独特型基因工程单链抗体。Bt Cry1C蛋白多克隆抗体、小菜蛾(Plutella xylostella)刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMV)蛋白和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)BBMV蛋白对E8-Anti-Id scFv的竞争抑制中浓度(IC_(50))分别为2.625、3.638和4.605μg/mL。室内生物测定显示,噬菌体展示形式的E8-Anti-Id scFv在滴度为1.2×10^(8) CFU/mL浓度条件下,对供试的小菜蛾和稻纵卷叶螟在72 h内的校正死亡率为58.69%和52.82%,其抗虫活性分别达到浓度为20μg/mL的原Bt Cry1C蛋白的77.87%和73.21%。由此表明,获得的E8抗独特型基因工程单链抗体材料初步具备模拟Bt Cry1C蛋白抗虫功能的特性,为后期深入研究和推进应用奠定了技术和材料基础。

抗虫基因Cry1C转化大豆的研究

[目的]将对鳞翅目害虫具有抗性的抗虫基因Cry1C转入大豆中,获得对田间鳞翅目害虫具有抗性的大豆材料。[方法]利用农杆菌介导法将抗虫基因Cry1C转入大豆品种Williams82中,并通过Bar试纸条及PCR方法对所获得的转化苗进行鉴定。[结果]获得28株阳性大豆转化植株。[结论]初步认定Cry1C基因已整合到大豆基因组中。

苏云金芽孢杆菌菌株YBT1535转cry1C基因菌的构建

利用电脉冲将cry1C基因转入苏云金芽孢杆菌野生菌株YBT15 35 ,筛选得到 3个转化子。质粒电泳、PCR扩增及Southern杂交结果均证明 ,基因cry1C已转入菌株YBT15 35。生物测定结果表明 ,3个转化子对甜菜夜蛾的毒力比出发菌YBT15 35均有显著的提高 ,转化子YBT15 35 1和YBT15 35 3对小菜蛾和棉铃虫的生物活性与出发菌YBT15 35相近 ,而转化子YBT15 35 2则有一定幅度的提高。

转化cry1C基因对苏云金芽胞杆菌杀虫活性的影响

将含基因cry1C的质粒 ,通过电脉冲法转入含基因Cry1C的质粒 ,通过电脉冲法转入含基因Cry1Ab、Cry1Ac和cry2的对小菜蛾具有高毒力的苏云金芽胞杆菌野生菌株YBT 80 3 1中 ,得到转化子BMBY 0 0 3。PCR和SDS PAGE分析显示 ,Cry1C可在其中正常复制、表达 ,但使受体菌部分内源质粒发生丢失。生物测定结果表明 ,转化子BMBY 0 0 3既对甜菜夜蛾有毒力 ,LC50 值为 1 1 78μL/mL ,高于出发菌株YBT 80 3 1 (LC50 1 879μL/mL) ,也对小菜蛾有毒力 ,LC50 值为 1 96 8μL/mL ,低于YBT 80 3 1 ((LC50 1 1 43 μL/mL)。表明cry1C转入后 ,提高了野生菌株YBT 80 3 1对甜菜夜蛾的毒力 ,却降低了对小菜蛾的毒力。

抗鳞翅目害虫基因cry1C的抗原表位分析及多克隆抗体制备

利用生物信息学方法预测cry1C蛋白的抗原表位区,并命名为Δcry1C。优化Δcry1C的核苷酸序列并进行人工合成,构建重组表达载体pET28b(+)-Δcry1C。在E.coli中诱导表达His6-Δcry1C蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,分离、纯化获得cry1C多抗血清。ELISA测定结果表明,抗体效价最高可达1∶512 000。Western Blot分析结果表明,cry1C多克隆抗体能够与cry1C转基因抗虫水稻蛋白特异性结合。利用生物信息学筛选抗原表位区并优化序列、原核表达重组蛋白、免疫制备cry1C多克隆抗体,为深入研究抗鳞翅目害虫植物提供了前提条件。

Cry1C蛋白对4种棉花害虫的致死效果

【背景】苏云金芽胞杆菌(Bt)属革兰氏阳性细菌,是目前世界上应用最广泛的杀虫剂。来自Bt的Cry1Ac基因自1997年商业化以来,其产生的蛋白对棉铃虫、红铃虫等鳞翅目害虫起到了很好的控制作用。但该基因对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟等害虫的控制作用较差,因此,需要寻找新的Bt基因亚型控制上述害虫。【方法】将Cry1C蛋白加到人工饲料上形成药膜后,接入低龄幼虫进行生物测定,以常规不加毒蛋白的饲料为对照,计算1、3、5、7 d后不同害虫的校正死亡率。【结果】随着Cry1C蛋白浓度的增加及时间的延长,甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的校正死亡率逐渐升高,Cry1C浓度为10μg·m L-1时,处理7 d后,甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的校正死亡率分别为100%和85.42%,表明甜菜夜蛾比斜纹夜蛾更敏感,而棉铃虫和玉米螟对Cry1C蛋白的敏感性较差。【结论与意义】Cry1C基因可作为控制棉田甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的有价值的候选基因,但是对棉铃虫和玉米螟无效。该研究为筛选新的Bt基因亚型用于防治不同的棉花害虫提供了数据参考。

大肠杆菌中表达Cry1C基因及其重组表达产物的纯化及复性

通过PCR方法将苏云金芽孢杆菌Cry1C基因从原始质粒中克隆出来。由于Cry1C基因携带了大量大肠杆菌稀有密码子,因此用PCR方法对其前86个密码子进行修改,以提高其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量。Cry1C蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式大量表达,将包涵体用8mol/L尿素溶解并用His TrapTM FF凝胶柱纯化。所得纯化蛋白在复性缓冲液中复性折叠,最终得到可溶并有生物活性(由三化螟活性实验验证)的蛋白。Cry1C蛋白纯度可达99.2%。

苏云金杆菌Cry1C毒素对甜菜夜蛾幼虫生长发育、存活及取食行为的影响

研究了苏云金杆菌Ｃｒｙ１Ｃ毒素对甜菜夜蛾幼虫生长发育、存活及取食行为的影响．结果表明，当饲料中所含毒素浓度增高时，幼虫历期延长，存活率降低，对饲料的拒食作用和选择作用增强，取食量和生长量减少．在毒素浓度相同的情况下，与敏感品系相比，抗性品系对含有毒素的饲料明显具有较强的适应能力．

转基因水稻T1C-1 Bt Cry1C基因的克隆、表达、纯化和实质等同性研究

将质粒p ET30a（＋）-Cry1C转入大肠杆菌进行表达,对其表达条件进行了优化,并评价了蛋白的表达和纯化效果。结果显示：最佳诱导时间、IPTG的终浓度和诱导温度分别为5h、0.6 mmol/L和25℃。大多数的靶蛋白以包涵体形式表达,通过纯化和复性,最终获得高纯度有活性的靶蛋白。通过SDS-PAGE Western Blot、糖蛋白测定、LC MS/MS鉴定和杀虫试验表明：大肠杆菌中表达的Cry1C蛋白和转基因水稻的Cry1C蛋白具有实质等同性。