苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究

以我室自行分离的对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88为材料,用PCR-RFLP方法从其质粒DNA文库中筛选到含cry2Ab基因的一个阳性克隆pZF858,序列测定发现,该片段含有cry2Ab全长基因,开放读码框为1902bps,编码由633个氨基酸组成的70.7kD蛋白,氨基酸同源性与已公布的cry2Ab基因同源性均为99.8%,经Bt基因国际命名委员会正式命名为cry2Ab4。根据cry2Ab4基因开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,PCR扩增获得cry2Ab4完整ORF,与大肠杆菌表达载体pET-21b连接,构建了重组表达质粒pET-2Ab4,质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实该基因表达了60kD的蛋白,生物测定表明,Cry2Ab4对棉铃虫和大豆食心虫具有高毒力,同时对小菜蛾和二化螟有一定的杀虫活性,而对亚洲玉米螟和甜菜夜蛾没有杀虫活性。

苏云金芽孢杆菌沉默基因cry2Ab3在大肠杆菌中表达及杀虫活性研究

对苏云金芽孢杆菌C0 0 2菌株cry2Ab基因阳性克隆pHT3 1 5 2Ab进行亚克隆和序列测定 ,在CenBank注册后经国际Bt杀虫蛋白基因委员会正式命名为cry2Ab3。序列分析表明该基因含有芽孢杆菌特异的RBS序列 ,但没有功能性启动子 ,为沉默基因。根据大肠杆菌T7表达载体pET 2 1b克隆位点和cry2Ab3开放阅读框架 (ORF)两端序列 ,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3 ,高保真PCR扩增获得cry2Ab3完整ORF ,经酶切、连接构建了重组表达质粒pET 2Ab3。表达质粒导入大肠杆菌BL2 1 (DE3 ) ,IPTG诱导后 ,SDS PAGE电泳证实了cry2Ab3的表达。生物测定显示诱导培养物对棉铃虫初孵幼虫和小菜蛾二龄幼虫具有杀虫活性 ,能明显抑制二化螟二龄幼虫生长 ,但对甜菜夜蛾和玉米螟没有明显活性。进一步提取Cry2Ab3蛋白 ,生测结果表明其对棉铃虫LC50 为 3 2 5 5 μg g。

苏云金芽胞杆菌cry2Ad基因的克隆及其表达产物的活性分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)SBT2是我国新分离出的一株野生菌株。扫描电镜显示该菌株产生双锥体形晶体。琼脂糖凝胶电泳发现其质粒图谱含有5个条带。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示此菌株产生130kD晶体蛋白。利用PCR-RFLP法进行杀虫基因类型鉴定,发现其含有cry1Aa、cry1Da、cry1Hb、cry1Jb、cry1Ka、cry1Ib、基因。Cry2Ad蛋白的活性至今未见研究报道,本研究克隆和测序了该基因。并对其进行了表达。生物活性测定结果表明其表达产物对舞毒蛾(Lymant-ria dispar)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)有低活性;对大猿叶甲(Colaphellus bowringi)无活性。

水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化

通过PCR从克隆载体pUC18-3Z/Cry2A*上扩增水稻偏爱型密码子优化的抗虫基因cry2A*,经限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切定向插入到原核表达载体pET-28a(+),成功构建了在表达蛋白的N端只带有6个组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-28a(+)/Cry2A*,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。通过对其表达条件进行优化,发现在IPTG浓度为0.05mmol/L、诱导时间为3h、诱导温度为20℃的表达条件下目的蛋白大部分以可溶形式进行表达。采用Ni-NTA亲和柱纯化得到高纯度目的蛋白,薄层扫描分析蛋白纯度达到95%。

昼夜节律蛋白Cry2作为结直肠癌预后和化疗敏感性预测因子的研究

目的:检测Cry2在结直肠癌组织中的表达,探讨Cry2在结直肠癌预后和辅助化疗敏感性预测中的作用。方法:收集16名规律接受包含5-氟尿嘧啶的新辅助化疗的结直肠癌切除术患者,使用实体肿瘤疗效评估标准评估化疗疗效,并根据疗效分为完全反应(CR)/部分反应(PR)和病灶稳定(SD)/病灶进展(PD)组,免疫组化检测Cry2表达,评分后进行双侧2检验。收集307名在2001年至2005年间接受结直肠癌切除术患者的肿瘤组织,制作组织芯片,免疫组化检测Cry2表达,用log-rank法进行单因素分析,用Cox回归模型进行多因素分析,用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。结果:CR/PR组Cry2表达较低,SD/PD组Cry2表达较高,差异显著(P<0.05)。307例中Cry2高表达者84人,平均生存83.46月,Cry2低表达者223人,平均生存100.10月,两组间差异显著(P<0.05)。Cry2低表达者预后较好。307例结直肠癌切除术患者Cry2表达高低风险比为1.70,其95%置信区间为1.09～2.66,差异显著(P<0.05),Cry2的表达是影响预后的独立因素。16例接受化疗的结直肠癌切除术患者Cry2表达高低风险比为2.88,其95%置信区间为1.03～8.06,差异显著(P<0.05),Cry2的表达是影响化疗预后的独立因素。结论:根据Cry2表达高低可预测结直肠癌新辅助化疗的疗效,也可预测结直肠癌患者的预后。

转cry1C~*及cry2A~*基因早粳稻Bt蛋白的时空表达和抗螟虫性

早粳稻空育131为受体,以根瘤农杆菌介导遗传转化法创制了转ubi启动子调控下的cry1C*及cry2A*基因早粳稻空育131 (cry1C*)和空育131(cry2A*)。为了研究转基因水稻Bt蛋白的时空表达特性及抗螟虫性,将不同转化事件形成的转基因早粳稻品系种植于田间,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测转基因水稻不同生长发育阶段不同器官的、以及成熟期糙米的Bt蛋白量,采用室内离体茎秆法接虫鉴定转基因水稻的抗螟虫性。结果显示,转基因早粳稻不同抗虫基因Bt蛋白量不同, cry1C*基因总是低于cry2A*基因的蛋白质表达量;不同生长发育时期Bt蛋白量不同,叶片和茎鞘等器官的Bt蛋白量为分蘖期<抽穗期<灌浆期,幼穗或糙米等器官的Bt蛋白量为抽穗期幼穗>灌浆期幼穗>成熟期糙米;不同器官Bt蛋白量不同,高低次序在分蘖期为叶片、茎鞘,抽穗期为叶片、幼穗和茎鞘,灌浆及成熟期为叶片、茎鞘、幼穗和糙米;同一抗虫基因不同转基因品系间抽穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官Bt蛋白量及抗螟虫性、糙米Bt蛋白量等性状存在差异,抽穗期各器官Bt蛋白量与抗螟虫性及成熟期糙米Bt蛋白量之间相关不显著,不论Bt蛋白量高或低的品系均表现为高抗螟虫。转基因早粳稻营养器官生长发育前期Bt蛋白量较低、后期较高,繁殖器官生长发育早期Bt蛋白量较高、晚期较低,营养器官通常比繁殖器官的Bt蛋白量高。在本研究范围内,不同基因及不同转化事件培育的转基因水稻Bt蛋白表达量高低不同,但所有的转基因早粳稻品系均表现高抗螟虫。

cry2Aa9m抗虫基因植物表达载体构建及对大豆的遗传转化

cry2Aa9m基因编码的杀虫晶体蛋白(ICPs)对鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Dipter)昆虫具有显著的毒杀作用,可防治大豆食心虫等害虫。试验构建了由豆荚特异性启动子Pmsg调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A,以抗除草剂bar基因为筛选标记,通过农杆菌介导法对绥农28大豆子叶节进行遗传转化,获得抗性株系8株。经PCR和RT-PCR检测结果证明,cry2Aa9m基因已经整合到大豆基因组中并得以表达。研究为抗大豆食心虫转基因育种产业化奠定基础。

转cry1Ac＋cry2Ab基因棉对棉田节肢动物群落的影响

以Bt棉和常规棉为对照,研究了转cry1Ac+cry2Ab棉对棉田节肢动物群落的影响。研究结果表明,转cry1Ac+cry2Ab棉田、转cry1Ac棉田和常规棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的结构与组成无明显差异;转cry1Ac+cry2Ab棉田刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田蜘蛛类、瓢虫类和捕食类天敌的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的多样性指数与转cry1Ac棉田和常规棉田相比均无明显差异,说明转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的稳定性和转cry1Ac棉和常规棉相比均无明显差异。

转Cry1Ac+Cry2Ab抗虫棉对3种害虫的存活、生长发育及中肠相关酶活性的影响

以转Cry1Ac基因棉花和常规非转基因棉花为对照,系统研究了转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花对棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾的存活、生长发育及中肠酶活性的影响。研究结果表明,与常规棉对照相比,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花和转Cry1Ac基因棉花叶片对3种害虫的慢性毒性差异较大,对每种害虫的抗性程度也有一定的差异;饲喂转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花和转Cry1Ac基因棉花叶片的3种害虫幼虫生长发育进度明显缓慢、体重明显减轻,相关酶活性也有不同程度的变化,但每种酶的变化有一定的差异。

光照节律改变对大鼠视网膜中Cry2表达的影响

背景Cry2存在于哺乳动物视网膜上，是生物钟振荡器环路中重要的调控因子。目的探讨光照节律改变对大鼠视网膜中Cry2表达的影响。方法将清洁级健康无眼疾SD大鼠30只按随机数字表法分成2个组，正常对照组大鼠在自然昼夜光线照明下喂养，实验组大鼠饲养在光照控制室内，大鼠活动平面光照度为（533±16）lx，设定每日光照明（6：00～24：00）、暗（24：00～6：00）循环交替时间为18h／6h，持续时间为3个月。于实验后3个月时在光学显微镜及透射电子显微镜下观察大鼠视网膜组织结构和超微结构的改变，采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中Cry2蛋白的表达，采用实时荧光定量PER法检测Cry2mRNA在视网膜组织中的表达变化。结果光学显微镜下可见，正常对照组大鼠喂养3个月时视网膜各层结构清晰，排列整齐，而实验组大鼠视网膜萎缩变薄，排列紊乱。透射电子显微镜下观察表明，正常对照组大鼠光感受器细胞外节膜盘结构清晰，内节线粒体嵴连续，外核层细胞核形态规则，但实验组大鼠光感受器内外节结构紊乱，外节膜盘间隙增大，出现溶解、空泡变，光感受器内节线粒体空泡变，视网膜外核层细胞核染色质浓集，部分出现核碎裂、边集，核膜皱缩、内陷。免疫组织化学检测显示，2个组大鼠Cry2蛋白均在视网膜节细胞及内核层部分细胞的细胞质和核膜阳性表达，实验组大鼠Cry2蛋白表达评分为（0．833±O．197）分，明显低于正常对照组的（1．700±0．245）分，差异有统计学意义（P=0．009）。实时荧光定量PCR定量检测结果显示，正常对照组大鼠视网膜中Cry2mRNA表达量为0．962±0．125，实验组为0．615±0．100，差异有统计学意义（P=0．006）。结论533lx的光照强度长期节律性照射可导致大鼠视网膜组织结构损伤，其机制可能与视网膜中Cry2的表达下调有关，调整Cry2的表达是否是临床上稳定生物节律的一个重要环节值得探讨。

苏云金芽孢杆菌cry2 Aa操纵元蛋白对杀虫蛋白晶体形成作用的研究

利用重叠PCR的方法 ,通过两次PCR扩增 ,分别获得cry2Aa1 0操纵元的orf1、orf1 +orf2与cry2Ab5基因的融合片段。融合片段经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切与pHT31 5连接 ,分别构建了基因融合片段的原核表达载体pFU(orf1 +2Ab)和pFU(orf1 +orf2 +2Ab) ,电转化Bt无晶体突变株 4Q7后 ,扫描电镜下可观察到典型的方形晶体 ,通过SDS PAGE可检测到 6 0kD大小的蛋白表达带。结果表明 ,cry2Ab5可在cry2Aa1 0的启动子帮助下有效转录和表达 。

隐花色素CRY2基因片段克隆及RNAi植物表达载体的构建

隐花色素是植物向光反应的主要的光受体,介导蓝光/近紫外光调控的反应。在拟南芥中CRY2调节去黄化反应并控制开化时间。我们根据在GenBank中已经发表的拟南芥(NM_100320)、中国大白菜(AY176689)、油菜(AJ889779)CRY2基因的cDNA保守序列设计并合成同源引物。通过RT-PCR方法从"津田"芜菁(Brassica rapa L.subsp.rapa"Tsuda")总RNA中扩增出CRY2基因的cDNA部分片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR221中。测序表明,该片段与拟南芥具有87%的同源性,与油菜和中国大白菜的同源性达97%以上。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pH7GWIWG2(I)为基础,构建了由组成型启动子35S调控的CRY2基因的ihpRNAi植物表达载体。

利用农杆菌介导法获得转cry2A抗虫基因水稻的研究

稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫对cry2A*编码的Bt毒性蛋白有明显的排斥效应,从而可达到抗虫的效果。本研究利用农杆菌介导法,将载有cry2A*基因的pC-2A质粒转入受体水稻品种镇稻88基因组内,获得转基因植株。由于cry2A*与抗Basta基因紧密连锁,通过Basta抗性筛选,进而得到转cry2A*基因阳性株。PCR和AGE分析结果表明,外源基因cry2A*已成功整合到镇稻88基因组内。田间试验结果显示转基因阳性植株有明显的抗虫效果。

拟南芥蓝光受体CRY2的功能及其介导的光形态建成

植物具备一套复杂的由两种蓝光受体和多种信号转导下游组分组成的蓝光感应系统,通过感受光照强度、光的方向和光周期,调节自身对蓝光的应答.蓝光反应的有效波长是蓝光和近紫外光(320～400nm),故蓝光受体也叫蓝光/近紫外光受体.CRY2(Cryptochromes,CRY)是一个核蛋白,在转录水平受蓝光的调节,它的作用是增加拟南芥对蓝光的敏感性.植物蓝光调节的反应主要有向光性、抑制幼茎伸长、叶绿体迁移、刺激气孔张开和调节基因表达等.对植物蓝光反应突变体分子生物学研究进展进行了综述,对蓝光受体及信号转导下游组分在植物发育中的作用及蓝光诱发植物作出反应的分子机制进行了探讨.

转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎生长发育的影响

测定了转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎的致死作用及生长发育的影响。结果表明,与常规棉对照相比,转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫具有一定程度的控制作用,但不理想;转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫的生长发育有较大的影响,表现为使各虫态发育历期延长,化蛹时间和羽化时间延长,幼虫虫体质量和蛹质量减轻,化蛹率和羽化率明显降低。

取食Cry2Ab蛋白后棉铃虫幼虫中肠组织的病理变化

为了明确Cry2Ab杀虫蛋白的作用机制,利用透射电镜观察了棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)3龄末幼虫取食含Cry2Ab蛋白(8μg/g)饲料后中肠的组织病理变化,并与分别取食含Cry1Ac蛋白(0.97μg/g)饲料和正常饲料的棉铃虫进行了比较。结果表明:棉铃虫取食Cry2Ab蛋白后中肠细胞及其细胞器均发生了明显的病变,主要表现为:中肠杯状细胞的杯腔肿胀或拉长,部分柱状细胞被杯状细胞挤压出来,微绒毛脱落,细胞核皱缩,质膜和核膜不清晰,染色质凝聚,线粒体拉伸变形,内质网肿胀断裂;并且随着取食时间的延长病变越来越明显。与取食Cry1Ac蛋白的棉铃虫相比,Cry2Ab引起棉铃虫中肠组织发生病变的速度较慢。本研究可为Cry2Ab作为转基因棉花的重要杀虫蛋白在将来更好地发挥作用提供理论依据。

转Cry1Ac+Cry2Ab棉花生长势及其对棉田节肢动物物种丰富度的影响

【背景】转基因棉花在商业化种植之前,必须评价其环境安全性。其中新型棉花材料的生存竞争能力和对物种丰富度的影响是评价的重要内容。【方法】以转Cry1Ac＋Cry2Ab基因棉为试验材料,转Cry1Ac棉花中棉所41和非转基因棉花中棉所49为对照品种,分别于2014年5~9月对棉花株高、主茎叶片数、叶绿素含量、比叶面积、果枝数、蕾铃数等生长参数进行比较,同时对二代、三代和四代棉铃虫发生期棉田物种丰富度进行系统调查。【结果】转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花的生长势与转Cry1Ac棉花和非转基因棉花基本相当,没有表现出明显的竞争优势;产量构成参数在成铃和脱落等方面比非转基因棉表现出良好的优势。对棉田节肢动物物种丰富度的影响表明,转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花对靶标害虫棉铃虫具有良好的控制效果,对主要刺吸性害虫棉蚜、棉蓟马、烟粉虱、绿盲蝽与天敌龟纹瓢虫、草间小黑蛛、草蛉和小花蝽等的种群丰富度在个别时期有所影响,但总体上与转Cry1Ac棉田和非转基因棉田没有显著性差异。【结论与意义】转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花无竞争优势,但目标性状优势较好;对棉田节肢动物物种丰富度无明显影响。研究结果为新型转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花对棉田环境安全方面的研究进一步补充了内容,为转基因棉花的环境安全评价提供科学数据。

苏云金芽胞杆菌cry2Ab、cry9Ea基因的表达及活性分析

旨在为农业害虫防治提供更多的苏云金芽胞杆菌基因资源,从中国吉林市龙潭山土壤样品中分离得到野生菌株命名为Bt LTS-7,扫描电镜显示该菌株产生晶体形状为双锥体和正方体,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示该菌株产生130 kD和71 kD的晶体蛋白,通过PCR鉴定出该菌株中含有cry2Ab和cry9Ea基因,并成功克隆到了这两个新基因,并被Bt国际命名委员会正式命名为cry2Ab28和cry9Ea9,将两个基因分别在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,并进一步对其表达蛋白进行杀虫活性测定。结果显示,Cry2Ab28蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫具有杀虫活性,LC50为32.45μg/mL。Cry9Ea9蛋白对小菜蛾初孵幼虫(Plutella xylostella)具有较高杀虫活性,LC50为0.77μg/mL。

对甜菜夜蛾高杀虫毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ah5的克隆表达

利用生物活性测定方法从本实验室已分离保存的Bt菌株中筛选出了5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的菌株。该5株Bt菌株对甜菜夜蛾初孵幼虫的LC50值为0.556～0.914 mg/mL胞晶混合物,其中GS3菌株杀虫活性最高,LC50值为0.556 mg/mL胞晶混合物;包含晶体形态主要是球形、大菱形、小菱形等;所含基因类型主要是cry1Aa、cry1Ab、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ad、cry2Ah、cry7Ab、cry9Ba等;5株菌株均表达约60 kD和130～150 kD蛋白,其中2株还表达较弱的80 kD蛋白。从GS3菌株中克隆得到一种新的cry2A基因,Gen Bank登录号为KT692984,由Bt基因国际命名委员会命名为cry2Ah5。该基因开放阅读框为1899 bp,编码632个氨基酸,编码蛋白分子量为70.8 kD,等电点p I为8.18,与其他Cry2Ah蛋白序列相似性为97%～99%。该基因在大肠杆菌BL21（DE3）中表达约70 kD蛋白,与预测分子量相符。本研究筛选得到5株对甜菜夜蛾具有较高杀虫毒力的Bt菌株,克隆表达了一种新的cry2A基因cry2Ah5,为甜菜夜蛾的生物防治提供了新的菌株及基因资源。

转Cry1Ac+Cry2Ab棉对棉铃虫的控制作用及对天敌捕食烟粉虱功能反应的影响

文章以转Cry1Ac基因棉(中棉所41)和常规棉(中棉所49)为对照,研究了转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉(639020)在棉花生长的关键时期——蕾期(二代棉铃虫发生期)、花期(三代棉铃虫发生期)和花铃期(四代棉铃虫发生期)对棉铃虫的控制作用,同时研究了639020棉田主要捕食性天敌(中华草蛉幼虫、龟纹瓢虫、小花蝽和草间小黑蛛)对烟粉虱的捕食功能,明确了639020棉花在生长的关键时期对棉铃虫的控制效果及对棉田主要捕食性天敌捕食功能反应的影响。结果表明,639020棉花对二代和三代棉铃虫具有良好的控制作用,抗虫性分别比中棉所41提高了52.85%和16.22%,其中前者差异达显著水平,后者差异不显著。在棉花蕾期、花期和花铃期,639020棉田棉铃虫落卵量都比中棉所41棉田和中棉所49棉田低(除二代棉铃虫发生期);棉铃虫幼虫数量都极显著低于常规棉,且都低于防治指标,但与中棉所41棉田无显著差异。639020棉田中华草蛉、龟纹瓢虫、小花蝽和草间小黑蛛对烟粉虱的捕食功能与中棉所41棉田和常规棉田相比无显著变化。研究结果以期为新型转基因棉花环境安全性研究及其外源基因的抗虫遗传效应和生产应用前景进行安全性评价。