表面等离子共振传感检测Cry2A蛋白

目的:建立利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)传感器检测转基因植物中苏云金芽孢杆菌Cry2A蛋白的方法。方法:利用SPR检测技术,根据生物分子间的相互作用,在金片表面修饰Cry2A蛋白的特异性单克隆抗体,对不同质量浓度梯度的Cry2A蛋白进行检测研究。结果:该方法可有效地检测到Cry2A蛋白,检测灵敏度可达10 ng/m L,与同为抗虫基因编码的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白未出现交叉反应。结论:利用SPR方法检测Cry2A蛋白操作简单,省时且灵敏度高、特异性强,可用于对Cry2A蛋白的定性检测。

转cry1C~*及cry2A~*基因早粳稻Bt蛋白的时空表达和抗螟虫性

早粳稻空育131为受体,以根瘤农杆菌介导遗传转化法创制了转ubi启动子调控下的cry1C*及cry2A*基因早粳稻空育131 (cry1C*)和空育131(cry2A*)。为了研究转基因水稻Bt蛋白的时空表达特性及抗螟虫性,将不同转化事件形成的转基因早粳稻品系种植于田间,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测转基因水稻不同生长发育阶段不同器官的、以及成熟期糙米的Bt蛋白量,采用室内离体茎秆法接虫鉴定转基因水稻的抗螟虫性。结果显示,转基因早粳稻不同抗虫基因Bt蛋白量不同, cry1C*基因总是低于cry2A*基因的蛋白质表达量;不同生长发育时期Bt蛋白量不同,叶片和茎鞘等器官的Bt蛋白量为分蘖期<抽穗期<灌浆期,幼穗或糙米等器官的Bt蛋白量为抽穗期幼穗>灌浆期幼穗>成熟期糙米;不同器官Bt蛋白量不同,高低次序在分蘖期为叶片、茎鞘,抽穗期为叶片、幼穗和茎鞘,灌浆及成熟期为叶片、茎鞘、幼穗和糙米;同一抗虫基因不同转基因品系间抽穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官Bt蛋白量及抗螟虫性、糙米Bt蛋白量等性状存在差异,抽穗期各器官Bt蛋白量与抗螟虫性及成熟期糙米Bt蛋白量之间相关不显著,不论Bt蛋白量高或低的品系均表现为高抗螟虫。转基因早粳稻营养器官生长发育前期Bt蛋白量较低、后期较高,繁殖器官生长发育早期Bt蛋白量较高、晚期较低,营养器官通常比繁殖器官的Bt蛋白量高。在本研究范围内,不同基因及不同转化事件培育的转基因水稻Bt蛋白表达量高低不同,但所有的转基因早粳稻品系均表现高抗螟虫。

转基因抗虫水稻‘HD2’不同生长发育阶段cry2A^(*)基因表达量

本研究旨在探究转cry2A^(*)基因抗虫水稻‘HD2-1’等独立系在田间生长发育过程中cry2A^(*)基因表达量及糙米Bt蛋白含量(BPC)。利用qRT-PCR方法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测水稻‘HD2-1’等独立系田间不同生长发育阶段组织器官及糙米的cry2A^(*)基因表达量。结果显示,不同水稻独立系cry2A^(*)基因表达量及糙米BPC明显不同,叶片、茎鞘及幼穗cry2A^(*)基因表达量在不同生长发育阶段间往往呈正相关,cry2A^(*)基因mRNA表达量和对应的BPC呈极显著的正相关,糙米BPC和各生长发育阶段各器官cry2A^(*)基因表达量存在正相关趋势。水稻‘HD2’cry2A^(*)基因表达量不同生长发育阶段间及其和糙米BPC间呈正相关。cry2A^(*)基因转录表达越高,BPC越高。

Cry2A蛋白的石英晶体微天平检测

目的:建立检测苏云金芽孢杆菌Cry2A蛋白的石英晶体微天平(quartz crystal microbalance,q CM)传感方法。方法:根据抗原抗体相互作用原理,利用q CM技术,在金片表面修饰抗原所对应的单克隆抗体,对苏云金芽孢杆菌Cry2A蛋白进行检测研究。结果:该方法灵敏度达到1 μg/m L,特异性好、重复性高。结论:该方法有利于为苏云金芽孢杆菌蛋白检测提供新思路,可以应用到实际样品的检测,在农产品转基因检测和进出口检验检疫中具有很好的应用前景。

Cry2A杀虫蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

通过PCR方法从克隆载体上扩增转基因水稻中的抗虫基因cry2A,经限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切定向插入到原核表达载体pET-30a(+)中,成功构建了蛋白表达载体pET-30a(+)/Cry2A,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。通过对其表达条件进行优化,发现在IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导时间为6h、诱导温度为30℃的表达条件下,目的蛋白表达量最高,大部分以包涵体形式表达。将包涵体裂解并用Ni-NTA亲和柱纯化,所得纯化蛋白在复性缓冲液中复性,最终得到有活性的高纯度目的蛋白。

多年种植Bt稻后外源蛋白在土壤中的积累

外源蛋白在环境中的残留与积累是转Bt基因作物环境安全评价的重要内容之一。我国已育成多个具有商业化前景的Bt稻品系,但目前多年种植Bt稻后Bt外源蛋白是否会在土壤中积累还不清楚。本研究在同一试验田连续9年种植了转cry1Ab/1Ac基因明恢63(华恢1号)和转cry2A基因明恢63水稻,采用酶联免疫吸附法(ELISA)跟踪监测了分蘖期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量变化,试验第1年(2012年)和最后1年(2020年)还测定了苗期、开花期和成熟期根际土中外源蛋白含量。结果表明:2012年,转cry1Ab/1Ac基因明恢63在苗期、分蘖期、开花期、成熟期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量分别为1.25、1.77、1.97、1.71和0.30 ng·g^(-1),2020年分别为1.30、1.69、2.03、1.77和0.43 ng·g^(-1);2012年,转cry2A基因明恢63在苗期、分蘖期、开花期、成熟期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量分别为0.91、1.52、1.53、1.37和0.12 ng·g^(-1),2020年分别为0.95、1.43、1.61、1.40和0.15 ng·g^(-1)。多因素方差分析显示,时间效应对Bt外源蛋白积累不显著,而品种和生育期效应显著。Bt稻生长过程中根际土中可以检测出微量的Bt外源蛋白,但收获后60 d已经基本降解完毕,根际土中Bt外源蛋白含量不会随着种植时间的增加而累积。