基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白,其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治,产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点,特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰,为其功能修饰和创新应用创造了条件,相关研究蓬勃发展,成效显著。大量研究表明,采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略,是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段;此外,采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略,也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制,梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展,并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果,探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径,为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

低温胁迫对Bt棉纤维中杀虫蛋白含量及氮代谢的影响

本研究以常规种泗抗1号(Sikang 1,SK1)和杂交种泗抗3号(Sikang 3,SK3)为材料进行盆栽试验,研究了不同低温水平及其处理持续时间对Bt棉盛铃期纤维中杀虫蛋白含量变化及氮代谢生理特征。结果表明,纤维中的杀虫蛋白含量随着温度的降低总体呈下降趋势,同时低温处理持续期显著影响杀虫蛋白含量。与对照相比,纤维中杀虫蛋白含量的降低幅度随低温胁迫时间的延长而增大。此外,随着处理温度的降低,可溶性蛋白含量、谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性呈下降趋势,游离氨基酸含量、肽酶活性、蛋白酶活性呈上升趋势,且在低温处理48 h后,均与杀虫蛋白含量呈极显著相关。因此,低温胁迫促使了蛋白质的合成功能下降,分解能力增强,导致可溶性蛋白含量下降,游离氨基酸含量升高,最终导致杀虫蛋白含量下降,且其受低温胁迫持续期显著影响。

新型高效杀虫蛋白绿色无害

近日,中国农业科学院棉花研究所李付广研究员团队在棉花中发现一种新型高效杀虫蛋白,具有广谱杀虫效果且绿色无害。若利用其机制制成生物农药,在防控草地贪夜蛾、棉铃虫等农作物重大鳞翅目害虫方面将具有广阔的应用前景。相关研究成果日前发表于国际期刊《自然植物》。进一步研究显示,该蛋白的杀虫机制与此前常用的抗虫蛋白--苏云金芽孢杆菌蛋白的杀虫机制完全不同,其杀虫谱系甚至可能更广。该团队随后培植了含有大量该杀虫蛋白的棉花、玉米、水稻,均表现出对草地贪夜蛾、棉铃虫、玉米螟等在内的鳞翅目害虫的高抗性。

棉花源新型高效广谱杀虫蛋白可有效防控鳞翅目害虫

近日,中国农业科学院棉花研究所棉花分子遗传改良创新团队在棉花中发现了一个新型高效广谱杀虫蛋白,可以高效毒杀鳞翅目害虫。该研究在棉花中鉴定到一个天然的新型杀虫蛋白,对棉铃虫和草地贪夜蛾均表现出显著抗虫性,且该蛋白的杀虫机制与苏云金芽孢杆菌蛋白的杀虫机制完全不同,两种蛋白具有良好互补性,其杀虫谱更广。该研究创制了过表达该杀虫蛋白的棉花、玉米、水稻、烟草新种质,展现出了对草地贪夜蛾、棉铃虫、玉米螟、稻纵卷叶螟、小菜蛾、烟草天蛾、大蜡螟、甜菜夜蛾、二化螟、斜纹夜蛾等在内的鳞翅目害虫的高抗性。研究结果表明,该杀虫蛋白对鳞翅目害虫具有广谱杀虫性,可作为绿色生物农药用于防控多种类型的鳞翅目害虫且对环境友好无残留,可替代苏云金芽孢杆菌基因发展抗鳞翅目害虫作物,将在全球农业生产中发挥重要作用。相关研究成果发表在《自然植物(Nature Plants)》。

具杀虫功能的蛋白类生物材料研究进展

害虫是威胁农作物生长发育及产品品质的主要风险因素,对其有效防治是保障农作物稳定生产的重要环节。传统依赖化学农药对害虫防治效果显著,但化学农药本身对非靶标生物以及生态环境所造成的持久性危害风险也同样突出。害虫绿色防治是农业可持续发展的必然要求,其中具杀虫功能的蛋白类生物材料因兼具安全性高、可量产药剂及可在转基因抗虫作物应用的多重优势,是害虫绿色防治创新研发和应用的热点。如具备杀虫功能的Bt毒素、凝集素、动物毒素、防御素、蛋白酶抑制剂等蛋白类生物材料在害虫防治上已有深入研究和广泛应用;此外,近年来包括杀虫抗体在内的一些新型杀虫蛋白和相应创新技术也不断涌现,发展极为迅猛。基于此,本文在系统梳理当前成熟的具杀虫功能的蛋白类生物材料研发和应用现状的基础上,结合作者团队在杀虫抗体靶向设计上取得的原创性研究成果和经验,对蛋白类生物杀虫材料潜在的创新研发与应用进行展望,旨在为农业害虫绿色防治研究提供最新文献资料和技术参考。

对半翅目害虫具有活性的Bt杀虫蛋白研究进展

半翅目害虫寄主范围广、危害时间长,给我国农林业生产带来了严重的经济损失。应用有效的绿色防控手段替代化学杀虫剂防治半翅目害虫,对于保障粮食安全生产、保护动物及人类生命健康、维护生态平衡具有重要意义。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis产生的杀虫蛋白对多种害虫展现出高效特异的杀虫活性,对非靶标生物安全,为全球农业、林业和卫生害虫的绿色防控做出了突出贡献。本文综述了我国农林业中重要的半翅目害虫种类、危害特点及主要防治手段,重点归纳了Bt杀虫蛋白对半翅目害虫的杀虫活性研究进展以及挖掘具有半翅目杀虫活性的Bt杀虫蛋白基础,并针对Bt杀虫蛋白在半翅目害虫绿色防控方面的应用提出了建议。

转基因抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白的时空表达分析

玉米是我国最重要的粮食作物之一,虫害会造成严重的品质和产量损失,转Bacillus thuringiensis(Bt)基因抗虫玉米为玉米害虫的防治提供了新途径。转Bt基因抗虫玉米的抗虫性与外源杀虫蛋白表达量具有密切的关系,明确Bt杀虫蛋白在不同生育期和不同器官中的表达量,对害虫的综合防治和农业转基因生物安全管理具有重要意义。连续两年采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了9个地点种植的瑞丰125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量,对比分析了玉米拔节期(V6-V8)叶片、抽雄期(VT)雄穗、吐丝期(R1)叶片和花丝、成熟期(R4)叶片和籽粒的Bt杀虫蛋白含量,结果表明Bt杀虫蛋白表达量在不同玉米器官中差异较大。2年9个地点的数据整体上呈现出叶片中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较高,而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较低的规律。9个地点种植的瑞丰125的Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量有所差异,但差异整体较小。

高温干旱下缩节胺通过调节碳和氨基酸代谢提高Bt棉杀虫蛋白含量的生理机制

【目的】探讨高温干旱胁迫下缩节胺(mepiquat chloride,DPC)调控Bt(Bacillus thuringiensis)棉杀虫蛋白含量的生理机制,为高抗虫性Bt棉品种选育及高产高效栽培提供理论依据。【方法】2020—2021年以转Bt抗虫基因抗虫棉品种泗抗3号为材料,采用盆栽法,在人工气候室进行高温干旱胁迫,胁迫开始后立即用20 mg·L^(-1) DPC和清水(对照)喷施。7 d后测定铃壳杀虫蛋白含量、α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量以及谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸转氨酶活性、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量。并进行转录组测序,利用DESeq进行差异基因分析,通过GO富集和KEGG Pathway数据库注释参与DPC调节杀虫蛋白含量的差异表达基因。【结果】与清水对照相比,DPC可显著提高高温干旱条件下Bt棉铃壳中杀虫蛋白含量,提高幅度达4.7%—11.9%。在碳代谢方面,α-酮戊二酸含量、丙酮酸含量提高46%—57%和25%—29%;在氨基酸代谢方面,谷氨酸合酶活性、谷氨酸草酰乙酸转氨酶活性、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量分别提高32%—44%、30%—40%、28%和22%—27%。转录组分析结果表明,DPC处理后上调基因7542条,下调基因10449条。GO和KEGG结果显示,差异基因主要涉及氨基酸代谢、碳代谢等生物过程。其中编码6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶、谷氨酸丙酮酸转氨酶、丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶、谷氨酸合酶、吡咯啉-5-羧酸脱氢酶、谷氨酸草酰乙酸转氨酶、N-乙酰谷氨酸合成酶、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶基因表达显著上调。【结论】高温干旱下,DPC通过调节碳、氨基酸代谢增加丙氨酸、α-酮戊二酸含量,提高天冬氨酸、谷氨酸、丙酮酸和精氨酸合成能力,进而提高Bt棉杀虫蛋白含量。

土壤增氮对棉花当日花Bt杀虫蛋白含量影响及相关生理机制

以Bt棉常规品种泗抗1号、杂交品种泗抗3号为材料,在常规施氮量(CK,300 kg·hm^(-2))水平上,设计增施氮素25%、50%、75%、100%4个处理,探讨土壤增氮对棉花当日花中Bt杀虫蛋白含量的影响及其蛋白质代谢机制。结果表明:两类型品种当日花中Bt杀虫蛋白含量均随施氮量增加呈先升高后降低的趋势,且在施氮量增加75%时当日花中Bt蛋白含量达最大值,较CK增加37.8%~85.2%。氮代谢生理机制表明,施氮量增加75%时当日花可溶性蛋白质含量、游离氨基酸含量、蛋白质合成关键酶[谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酸合成酶(glutamate synthase,GOGAT)]活性显著提高;蛋白质分解关键酶(蛋白酶、肽酶)活性则随施氮量增加呈下降趋势,但处理间差异不显著。在常规施氮水平上适量增氮有利于促进Bt杀虫蛋白合成,从而提高棉花Bt抗虫性。

喷施尿素对Bt棉蕾的杀虫蛋白含量影响及氮代谢机制

以常规种泗抗1号(SK-1)和杂交种泗抗3号(SK-3)作为试验材料,设置喷清水(CK)和不同浓度(1.0%~10.0%)尿素处理,研究喷施不同浓度尿素对Bt棉蕾中杀虫蛋白表达量的影响。结果表明:随着尿素浓度的增加,棉蕾中杀虫蛋白含量呈先增加后降低的趋势,尿素浓度7.0%~8.0%处理的棉蕾中杀虫蛋白含量最高,较对照增加14.9%~24.8%。氮代谢机制表明,棉蕾中可溶性蛋白质和游离氨基酸含量增加,谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活性提高,与Bt杀虫蛋白含量表现一致;蛋白酶和肽酶活性与Bt蛋白含量量呈相反特征。主成分分析进一步表明,两品种棉蕾的可溶性蛋白质和游离氨基酸含量,GS、GOGAT、GOT和GPT活性对Bt杀虫蛋白含量变化的贡献分别达71.8%和72.4%;蛋白酶和肽酶活性对Bt杀虫蛋白含量变化的贡献分别为23.4%和21.6%。综上,蕾期根外喷施尿素,Bt棉蕾的蛋白质合成提高是杀虫蛋白含量提高的主要原因。

土壤增氮对棉铃对位叶Bt杀虫蛋白含量影响及氮代谢机制

为探讨土壤增氮对Bt棉棉铃对位叶杀虫蛋白表达量影响程度及相关的氮代谢生理机制,提高Bt棉花铃期抗虫性的农学调节提供理论和技术支撑。采用裂区设计,以Bt棉常规品种泗抗1号(SK-1)、杂交品种泗抗3号(SK-3)为材料,在常规施氮量300kghm^(-2)基础上,设计施氮量分别增加25%、50%、75%、100%的处理,研究土壤增氮对Bt棉棉铃对位叶杀虫蛋白表达量影响。结果表明,2个类型品种棉铃对位叶中Bt杀虫蛋白含量均随增施氮量提高呈一直增加的特征,与对照相比,施氮量增加25%~100%,棉铃对位叶Bt杀虫蛋白增加6.1%~96.9%。氮代谢生理机制进一步表明,棉铃对位叶中可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量、谷氨酸丙酮酸转氨酶活性和谷氨酰胺合成酶活性的变化趋势与Bt蛋白含量表现一致,而蛋白质分解关键酶(蛋白酶、肽酶)活性则随施氮量的增加呈下降趋势。叶面积指数(LAI)随增施氮量的提高而增大,而产量则随土壤氮量的增加呈先升高后降低特征,最适LAI和产量最大值均出现在常规施氮的1.25倍(375 kg hm^(-2))。综上,在常规施氮基础上适量增施氮肥有利于棉铃对位叶中Bt蛋白的合成、最适LAI的形成和产量的提高,有利于实现Bt棉丰产性和抗虫性协同表达。

杀植物线虫的Bt菌Cry蛋白研究进展

植物寄生线虫(Plant parasitic nematodes)对农林业生产造成了巨大的经济损失,为减少环境污染,发展绿色农业,生物防治愈发受到关注。Bt菌(Bacillus thuringiensis, Bt)作为一种重要的生防细菌,对鳞翅目、鞘翅目、双翅目和线虫具有特异性的杀虫活性,对人类和非靶标昆虫无害。文章对已报道的Bt菌及其杀植物线虫Cry蛋白种类、结构特征和杀虫机制等方面研究进展进行了简要综述。

转Bt基因水稻Cry1Ab杀虫蛋白在水稻土中的降解

室内研究了转 Bt基因水稻克螟稻 2号和华池B6 叶片中的Cry1Ab杀虫蛋白在稻田水稻土中的降解动态。分别将克螟稻 2号的粉碎叶片和华池B6 的整张叶片埋入 3种土壤 (即老黄筋泥田、青紫泥田和黄松田 )中 ,此后每隔 6～ 10d测定土壤或叶片中的Cry1Ab含量。克螟稻 2号粉碎叶片中的Cry1Ab均以处理后的前 36d,尤其是前 6d的降解较快 ,其中在青紫泥田中最快 ,黄松田中最慢。在处理后 6～ 36d内 ,不同土壤中的Cry1Ab残留量有显著差异 ,黄松田中的明显最高 ,老黄筋泥田中的次之 ,青紫泥田中的为最低 ;此后土壤间的残留量差异逐渐缩小 ,至处理后 78d差异已不明显。土壤淹水可显著加快华池B6 叶片中Cry1Ab的降解 ,且淹水后其降解动态在不同土壤之间十分相似 ;淹水对Cry1Ab降解的促进作用仅发生在前 12d之内 ,此后多数时间内残留量在淹水与非淹水处理间无显著差异。建立了各处理中Cry1Ab降解的动力学指数方程 ,相应地得出了其降解的半衰期。还讨论了土壤有机质和微生物等因子对土壤中Cry1Ab降解的影响。

法国研究人员发现一种来源于金黄杆菌的新颖二元杀虫蛋白可用于控制西部玉米根虫

西部玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera,WCR)是欧美玉米的重要经济害虫之一,抗药性进化速度很快,甚至对来源于不同苏云金芽孢杆菌菌株的一些商业化杀虫蛋白也产生了抗药性。法国学者在一项研究中发现了从几种金黄杆菌(Chryseobacterium)中分离出的一个新二元杀虫蛋白家族。

与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白类似的源自蕨类植物的新杀虫蛋白

鳞翅目昆虫危害全球农作物生产。在农作物中引入编码苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白的转基因技术可以增强对作物的保护,使其免受鳞翅目昆虫幼虫为害。对Bt蛋白广泛的田间进化抗性的担忧凸显了对具有不同作用机制或作用位点的新的杀虫蛋白的迫切需要。澳大利亚乐卓博大学的研究人员从蕨类植物中发现了一个新的杀虫蛋白家族。

Bt玉米杀虫蛋白含量的时空表达及对亚洲玉米螟的杀虫效果

利用ELISA方法对2个转Cry1Ab基因抗虫玉米品种MON810和Bt11在不同生育期、不同组织器官中杀虫蛋白的表达量进行了分析,利用室内生测方法研究了不同组织器官对亚洲玉米螟初孵幼虫杀虫效果,并分析了杀虫蛋白表达量与杀虫效果的相关性。结果表明,Cry1Ab杀虫蛋白在Bt玉米MON810和Bt11的不同生育期和组织中的表达量呈明显的时空动态变化,以营养生长阶段的心叶组织表达最高,分别为1880.6和1473.1ng·g-1,生殖生长阶段的花粉含量最低,分别为52.3和73.3ng·g-1。随着叶片的生长,叶片中的杀虫蛋白含量明显下降,生殖生长阶段的各组织器官的杀虫蛋白的含量因组织而异。不同Bt玉米品种间同一组织器官的杀虫蛋白表达量也存在一定差异。室内生测结果表明,2个Bt玉米各组织对亚洲玉米螟初孵幼虫具有很好的杀虫效果,心叶、苞叶、雌穗尖和籽粒中Bt杀虫蛋白表达量及取食的幼虫死亡率呈显著正相关,但Bt11花丝以及MON810和Bt11的雄穗中Bt杀虫蛋白的含量与杀虫效果不一致,说明Bt玉米杀虫活性的表达还会受到其它一些因素的影响。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株杀虫蛋白的纯化及活性鉴定

嗜线虫致病杆菌XenorhabdusnematophilaHB310是从河北省土壤中筛选出的一株昆虫病原线虫体内分离纯化获得的共生菌,该菌的发酵液对多种昆虫有较高的杀虫活性。利用85%饱和度的硫酸铵盐析分别获得胞内蛋白提取物和上清液中胞外蛋白提取物,生测结果表明这两种蛋白提取物中都含有胃毒素和血腔毒素。通过制备型非变性凝胶电泳对蛋白提取物进行分离和纯化,得到了3种有杀虫活性的毒素蛋白(毒素Ⅰ、毒素Ⅱ和毒素Ⅲ),胞内的毒素蛋白与分泌到胞外上清液中的毒素蛋白是同种蛋白。毒素Ⅰ和毒素Ⅱ对棉铃虫初孵幼虫有明显的胃毒活性,但没有血腔毒性;毒素Ⅲ对大蜡螟幼虫有很强的血腔毒性,LD50为0.18μg头。SDS_PAGE图谱显示毒素Ⅰ和毒素Ⅱ是由多个多肽组成的复合蛋白,而毒素Ⅲ只分离出一条多肽。毒素Ⅱ在50℃处理10min,其杀虫活性没有显著变化;70℃处理10min对毒素Ⅲ杀虫活性没有显著影响。

农杆菌介导将Bt杀虫蛋白基因导入优良玉米自交系的研究

以杂交育种中广泛使用的优良玉米自交系 34 0、4112为材料 ,用带有质粒pGBIL0 4(Pactin -Bt-Tnos)的根癌农杆菌LBA44 0 4转化其幼胚及其初始愈伤组织 ,共培养 3天后 ,在含PPT的培养基上连续筛选培养 3代 ,然后分化获得再生植株。PCR检测证明目的基因已整合到再生植株的基因组中。实验结果表明幼胚预培养后形成的新鲜的初始愈伤组织是比较适宜的转化受体 ,结果还发现将共培养温度降到 2 2℃可以提高农杆菌介导的玉米遗传转化的筛选频率。

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。

转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究

通过对转 Bt杀虫蛋白基因油菜植株的后代进行卡那霉素抗性分析和 PCR技术检测 ,结果表明 :Bt杀虫蛋白基因是以单拷贝、杂合地整合到转基因植株 (T0 1、T0 2、T0 3、T0 5、T0 6、T0 7、T0 8)的基因组中 ,并稳定地遗传。EL ISA检测表明 :在第 3～第 9叶期 Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中高效地表达 ,Bt杀虫蛋白的表达量为 170～ 2 6 0 ng/ 2 5mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 6 7%～ 0 .10 5 % ,其抗虫效果高达 72 .0 %～ 94 .4 %。但从第 11叶期后 Bt杀虫蛋白表达量显著地降低 ,只有 7～ 5 0 ng/ 2 5 mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 0 3%～ 0 .0 2 %。