基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白,其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治,产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点,特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰,为其功能修饰和创新应用创造了条件,相关研究蓬勃发展,成效显著。大量研究表明,采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略,是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段;此外,采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略,也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制,梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展,并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果,探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径,为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

基于转录组分析的低铁胁迫下Bt棉苗杀虫蛋白表达量下降机制

研究低铁对Bt棉杀虫蛋白含量的影响及其生理和分子机制,可为Bt棉抗虫性安全表达提供理论参考。本文以转基因抗虫棉品种中棉50为试验材料,设置正常铁(CK,20.0µmol L^(–1))和低铁(LI,0.1µmol L^(–1))2个铁水平处理,采用水培法研究了低铁胁迫下Bt棉苗期Bt杀虫蛋白含量变化及氮代谢生理特征,通过转录组测序挖掘差异表达基因及其相关代谢途径,并采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。结果表明,与对照处理相比,低铁胁迫下Bt棉根和叶片中杀虫蛋白含量显著下降,且根中杀虫蛋白含量下降幅度更大。低铁胁迫降低了叶片中NH_(4)^(+)-N和NO_(3)^(–)-N含量,降低根和叶片中可溶性蛋白含量和全氮含量。根和叶片中硝酸还原酶、亚硝酸还原酶和谷氨酸合成酶活性的变化趋势与Bt杀虫蛋白含量表现一致。转录组结果表明,根和叶片中分别鉴定出11,661个和8972个差异表达基因,其中有1652个差异表达基因在根和叶片中均下调表达。GO注释表明,低铁处理根和叶片中差异基因的功能都主要富集于刺激反应、细胞壁、质膜、结合、氧化还原活性等。KEGG富集分析显示,苯丙烷类物质生物合成、苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、激素信号转导、玉米素生物合成、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢和酪氨酸代谢等途径在根和叶片中均发生显著变化。低铁胁迫下与氮素还原、同化途径相关的NR、NiR1和GLT1基因表达显著下调。以上结果表明,低铁胁迫会抑制Bt棉氮代谢相关基因的转录水平,减弱氮代谢的生理活性,抑制Bt杀虫蛋白的合成。

低温胁迫对Bt棉纤维中杀虫蛋白含量及氮代谢的影响

本研究以常规种泗抗1号(Sikang 1,SK1)和杂交种泗抗3号(Sikang 3,SK3)为材料进行盆栽试验,研究了不同低温水平及其处理持续时间对Bt棉盛铃期纤维中杀虫蛋白含量变化及氮代谢生理特征。结果表明,纤维中的杀虫蛋白含量随着温度的降低总体呈下降趋势,同时低温处理持续期显著影响杀虫蛋白含量。与对照相比,纤维中杀虫蛋白含量的降低幅度随低温胁迫时间的延长而增大。此外,随着处理温度的降低,可溶性蛋白含量、谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性呈下降趋势,游离氨基酸含量、肽酶活性、蛋白酶活性呈上升趋势,且在低温处理48 h后,均与杀虫蛋白含量呈极显著相关。因此,低温胁迫促使了蛋白质的合成功能下降,分解能力增强,导致可溶性蛋白含量下降,游离氨基酸含量升高,最终导致杀虫蛋白含量下降,且其受低温胁迫持续期显著影响。

转Bt基因水稻Cry1Ab杀虫蛋白在水稻土中的降解

室内研究了转 Bt基因水稻克螟稻 2号和华池B6 叶片中的Cry1Ab杀虫蛋白在稻田水稻土中的降解动态。分别将克螟稻 2号的粉碎叶片和华池B6 的整张叶片埋入 3种土壤 (即老黄筋泥田、青紫泥田和黄松田 )中 ,此后每隔 6～ 10d测定土壤或叶片中的Cry1Ab含量。克螟稻 2号粉碎叶片中的Cry1Ab均以处理后的前 36d,尤其是前 6d的降解较快 ,其中在青紫泥田中最快 ,黄松田中最慢。在处理后 6～ 36d内 ,不同土壤中的Cry1Ab残留量有显著差异 ,黄松田中的明显最高 ,老黄筋泥田中的次之 ,青紫泥田中的为最低 ;此后土壤间的残留量差异逐渐缩小 ,至处理后 78d差异已不明显。土壤淹水可显著加快华池B6 叶片中Cry1Ab的降解 ,且淹水后其降解动态在不同土壤之间十分相似 ;淹水对Cry1Ab降解的促进作用仅发生在前 12d之内 ,此后多数时间内残留量在淹水与非淹水处理间无显著差异。建立了各处理中Cry1Ab降解的动力学指数方程 ,相应地得出了其降解的半衰期。还讨论了土壤有机质和微生物等因子对土壤中Cry1Ab降解的影响。

Cry蛋白对多种马铃薯害虫的杀虫效果鉴定

【目的】研究Cry蛋白对马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、茄二十八星瓢虫(Henosepilachna vigintioctopunctata)3种马铃薯害虫的杀虫效果,为创制Cry转基因马铃薯抗虫植株提供基础。【方法】以‘希森6号’‘荷兰15’马铃薯为供试材料,上述3种害虫为供试昆虫,采用饲料添加法和叶片涂抹法施加Cry蛋白(Cry1B、Cry1Ac、Cry3A、Cry3B),设置无菌水(CK)和不同浓度的Cry蛋白处理组。通过比较各处理组间的幼虫死亡率和虫体质量来确定Cry蛋白对3种害虫的杀虫效果。【结果】Cry3A蛋白在10、20、100μg/g处理浓度下均能显著抑制2龄马铃薯甲虫幼虫虫体质量并提高其死亡率,而同浓度Cry1B蛋白处理与对照CK相比对2龄马铃薯甲虫幼虫的虫体质量无明显影响,表明Cry1B蛋白对该幼虫无杀虫效果。使用100μg/gCry1Ac和Cry1B蛋白分别饲喂草地贪夜蛾发现,Cry1Ac蛋白能够显著抑制草地贪夜蛾幼虫的生长,而Cry1B处理与CK相比并未显著影响幼虫虫体质量,表明Cry1B蛋白对草地贪夜蛾无杀虫效果。使用100μg/g Cry1B蛋白处理2龄茄二十八星瓢虫幼虫,其在抑制幼虫虫体质量和提高其死亡率方面有显著效果,其中第2天和第3天死亡率分别为50%和100%,表明Cry1B蛋白对茄二十八星瓢虫有良好的杀虫效果。【结论】Cry1Ac蛋白对草地贪夜蛾有杀虫效果,Cry3A蛋白对马铃薯甲虫有杀虫效果。而Cry1B蛋白对茄二十八星瓢虫有杀虫效果,但对马铃薯甲虫、草地贪夜蛾无杀虫效果。

新型高效杀虫蛋白绿色无害

近日,中国农业科学院棉花研究所李付广研究员团队在棉花中发现一种新型高效杀虫蛋白,具有广谱杀虫效果且绿色无害。若利用其机制制成生物农药,在防控草地贪夜蛾、棉铃虫等农作物重大鳞翅目害虫方面将具有广阔的应用前景。相关研究成果日前发表于国际期刊《自然植物》。进一步研究显示,该蛋白的杀虫机制与此前常用的抗虫蛋白--苏云金芽孢杆菌蛋白的杀虫机制完全不同,其杀虫谱系甚至可能更广。该团队随后培植了含有大量该杀虫蛋白的棉花、玉米、水稻,均表现出对草地贪夜蛾、棉铃虫、玉米螟等在内的鳞翅目害虫的高抗性。

棉花源新型高效广谱杀虫蛋白可有效防控鳞翅目害虫

近日,中国农业科学院棉花研究所棉花分子遗传改良创新团队在棉花中发现了一个新型高效广谱杀虫蛋白,可以高效毒杀鳞翅目害虫。该研究在棉花中鉴定到一个天然的新型杀虫蛋白,对棉铃虫和草地贪夜蛾均表现出显著抗虫性,且该蛋白的杀虫机制与苏云金芽孢杆菌蛋白的杀虫机制完全不同,两种蛋白具有良好互补性,其杀虫谱更广。该研究创制了过表达该杀虫蛋白的棉花、玉米、水稻、烟草新种质,展现出了对草地贪夜蛾、棉铃虫、玉米螟、稻纵卷叶螟、小菜蛾、烟草天蛾、大蜡螟、甜菜夜蛾、二化螟、斜纹夜蛾等在内的鳞翅目害虫的高抗性。研究结果表明,该杀虫蛋白对鳞翅目害虫具有广谱杀虫性,可作为绿色生物农药用于防控多种类型的鳞翅目害虫且对环境友好无残留,可替代苏云金芽孢杆菌基因发展抗鳞翅目害虫作物,将在全球农业生产中发挥重要作用。相关研究成果发表在《自然植物(Nature Plants)》。

Bt玉米杀虫蛋白含量的时空表达及对亚洲玉米螟的杀虫效果

利用ELISA方法对2个转Cry1Ab基因抗虫玉米品种MON810和Bt11在不同生育期、不同组织器官中杀虫蛋白的表达量进行了分析,利用室内生测方法研究了不同组织器官对亚洲玉米螟初孵幼虫杀虫效果,并分析了杀虫蛋白表达量与杀虫效果的相关性。结果表明,Cry1Ab杀虫蛋白在Bt玉米MON810和Bt11的不同生育期和组织中的表达量呈明显的时空动态变化,以营养生长阶段的心叶组织表达最高,分别为1880.6和1473.1ng·g-1,生殖生长阶段的花粉含量最低,分别为52.3和73.3ng·g-1。随着叶片的生长,叶片中的杀虫蛋白含量明显下降,生殖生长阶段的各组织器官的杀虫蛋白的含量因组织而异。不同Bt玉米品种间同一组织器官的杀虫蛋白表达量也存在一定差异。室内生测结果表明,2个Bt玉米各组织对亚洲玉米螟初孵幼虫具有很好的杀虫效果,心叶、苞叶、雌穗尖和籽粒中Bt杀虫蛋白表达量及取食的幼虫死亡率呈显著正相关,但Bt11花丝以及MON810和Bt11的雄穗中Bt杀虫蛋白的含量与杀虫效果不一致,说明Bt玉米杀虫活性的表达还会受到其它一些因素的影响。

嗜线虫致病杆菌HB310菌株杀虫蛋白的纯化及活性鉴定

嗜线虫致病杆菌XenorhabdusnematophilaHB310是从河北省土壤中筛选出的一株昆虫病原线虫体内分离纯化获得的共生菌,该菌的发酵液对多种昆虫有较高的杀虫活性。利用85%饱和度的硫酸铵盐析分别获得胞内蛋白提取物和上清液中胞外蛋白提取物,生测结果表明这两种蛋白提取物中都含有胃毒素和血腔毒素。通过制备型非变性凝胶电泳对蛋白提取物进行分离和纯化,得到了3种有杀虫活性的毒素蛋白(毒素Ⅰ、毒素Ⅱ和毒素Ⅲ),胞内的毒素蛋白与分泌到胞外上清液中的毒素蛋白是同种蛋白。毒素Ⅰ和毒素Ⅱ对棉铃虫初孵幼虫有明显的胃毒活性,但没有血腔毒性;毒素Ⅲ对大蜡螟幼虫有很强的血腔毒性,LD50为0.18μg头。SDS_PAGE图谱显示毒素Ⅰ和毒素Ⅱ是由多个多肽组成的复合蛋白,而毒素Ⅲ只分离出一条多肽。毒素Ⅱ在50℃处理10min,其杀虫活性没有显著变化;70℃处理10min对毒素Ⅲ杀虫活性没有显著影响。

农杆菌介导将Bt杀虫蛋白基因导入优良玉米自交系的研究

以杂交育种中广泛使用的优良玉米自交系 34 0、4112为材料 ,用带有质粒pGBIL0 4(Pactin -Bt-Tnos)的根癌农杆菌LBA44 0 4转化其幼胚及其初始愈伤组织 ,共培养 3天后 ,在含PPT的培养基上连续筛选培养 3代 ,然后分化获得再生植株。PCR检测证明目的基因已整合到再生植株的基因组中。实验结果表明幼胚预培养后形成的新鲜的初始愈伤组织是比较适宜的转化受体 ,结果还发现将共培养温度降到 2 2℃可以提高农杆菌介导的玉米遗传转化的筛选频率。

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。

转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究

通过对转 Bt杀虫蛋白基因油菜植株的后代进行卡那霉素抗性分析和 PCR技术检测 ,结果表明 :Bt杀虫蛋白基因是以单拷贝、杂合地整合到转基因植株 (T0 1、T0 2、T0 3、T0 5、T0 6、T0 7、T0 8)的基因组中 ,并稳定地遗传。EL ISA检测表明 :在第 3～第 9叶期 Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中高效地表达 ,Bt杀虫蛋白的表达量为 170～ 2 6 0 ng/ 2 5mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 6 7%～ 0 .10 5 % ,其抗虫效果高达 72 .0 %～ 94 .4 %。但从第 11叶期后 Bt杀虫蛋白表达量显著地降低 ,只有 7～ 5 0 ng/ 2 5 mg鲜叶 ,占植物可溶性蛋白的 0 .0 0 3%～ 0 .0 2 %。

转Bt基因作物释放杀虫晶体蛋白对土壤生态安全的影响

随着转Bt基因抗虫作物的大面积推广种植,其环境安全性问题日益引起关注。转Bt基因作物在生长期内持续不断地向环境释放杀虫晶体蛋白,这些杀虫晶体蛋白积累一旦超过了昆虫的消耗及环境因子对其的钝化,就可能对非靶标昆虫或土壤微生物造成伤害。转Bt基因作物向土壤中释放杀虫晶体蛋白的途径主要有3种:根系分泌、花粉飘落和秸秆还田。释放到土壤中的Bt杀虫晶体蛋白能够迅速被土壤活性颗粒吸附,1～3 h就能达到吸附平衡。吸附态Bt杀虫晶体蛋白不易被土壤微生物或酶降解,导致杀虫活性持续时间显著延长。土壤微生物种群变化是衡量Bt作物对土壤生态影响的重要指标。研究表明,Bt作物根系分泌物或Bt生物体降解释放的杀虫晶体蛋白对于土壤蚯蚓、线虫、原生动物、细菌和真菌没有毒性,但可使丛枝菌根真菌(AMF)菌丝长度减小,不能形成侵染单元。Bt杀虫晶体蛋白对土壤酶活性的影响程度依这类蛋白的导入方式或Bt作物生育期的不同而呈现差异。土壤中Bt Cry1Ab蛋白能被部分后茬作物吸收,但不同的商品试剂盒检测结果存在差异。文章综述了Bt杀虫晶体蛋白在土壤中释放、吸附、残留特性及其对土壤动物、土壤微生物、土壤酶活性和后茬作物的影响,旨在为转Bt基因作物释放杀虫晶体蛋白的土壤生态安全评价提供参考依据。

转Bt杀虫蛋白基因的抗棉铃虫棉花新种质

采用花粉管通道途径,将合成的 Bt 杀虫蛋白基因导入棉花优良品种泗棉3号和中棉所12号,获得了转基因植株。组织化学分析表明,GUS 标记基因已在 R_1代植株中得到表达。据对 GUS 阳性转基因棉株的 PCR 分析结果,证明 Bt 杀虫蛋白基因出现在 R_1代中,并通过自交传递至 R_2代。经鉴定,获得了5株对棉铃虫幼虫有高度毒杀作用的 R_1代单株S545、S591、S636、S1001(泗棉3号+Bt/GUS)及 Zh1109(中棉所12号+Bt/GUS),棉铃虫幼虫致死率分别达到91.6%、93.8%、92.3%、85.7%、75.0%。并由 R_1代自交后形成 R_2代抗虫棉群体,表明获得了抗棉铃虫棉花新种质。

苏云金杆菌辅助蛋白P20对杀虫晶体蛋白Cry1Ab表达的影响

苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis,简称Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab因其C 半端缺少了一段含 4个半胱氨酸的氨基酸序列而导致蛋白的不稳定 ,报道苏云金杆菌辅助蛋白P2 0帮助Cry1Ab蛋白的表达及晶体的形成。利用穿梭载体pHT310 1构建 3个表达质粒 ,即pT1B、pP1B和pDP1B ,3个质粒都含有cry1Ab基因 ,不同在于pT1B没有p2 0基因 ,pP1B含有p2 0全基因 ,而pDP1B不仅含有p2 0全基因 ,且在p2 0基因前插入cry1A(c)启动子。分别将这 3个表达质粒经电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型菌株CryB中 ,获得转化菌株T1B、P1B和DP1B。Westernblot表明cry1Ab基因在这 3株菌中均表达了 130kD的蛋白 ,部分降解为大约 6 0kD的蛋白。蛋白定量分析显示 ,3株菌 130kD蛋白量的比为 1∶1.4∶1 5 ,降解后的 6 0kD蛋白量的比为 1∶1.1∶1.6 ,Cry1Ab蛋白总量的比为 1∶1∶2∶1 6。镜检发现 ,Cry1Ab在 3株菌中都形成典型的菱形晶体 ,其晶体大小为T1B <P1B <DP1B。生物测定结果显示 ,3个菌株对棉铃虫 (Helicoverpaarmigera)均具有明显的杀虫活性 ,三者的LC50 差异不显著。研究表明 ,P2 0对cry1Ab基因的表达和晶体形成均有帮助 ,P2

新疆北部地区转Bt基因棉外源杀虫蛋白表达时空动态研究

为研究新疆北部地区转Bt基因棉外源杀虫蛋白时空表达规律,2009年和2010年以中棉所43、GK62、GK19和sGK321等4个转Bt基因抗虫棉为试验材料,利用ELISA技术对其不同器官的Bt杀虫蛋白进行测定。结果表明:年度间不同转基因抗虫棉品种Bt杀虫蛋白时空变化趋势基本一致,只是2年的Bt杀虫蛋白表达量不同,有些品种年度间差异明显;Bt杀虫蛋白含量因棉花器官的不同和棉花生育期的变化差异较大。各品种中Bt杀虫蛋白含量随棉花生育期的推进呈逐渐下降的趋势,以子叶期的子叶中的含量最高,子叶期、3叶期和7叶期的顶叶中的Bt杀虫蛋白含量明显高于现蕾期、开花期、结铃期和吐絮期的顶叶、蕾、花瓣和幼铃;棉蕾在现蕾期的Bt杀虫蛋白含量高于开花期和结铃期;花瓣在开花期的Bt杀虫蛋白含量高于结铃期。在现蕾期,顶叶中的Bt杀虫蛋白高于棉蕾;在开花期,棉蕾中的Bt杀虫蛋白含量高于顶叶,后者又高于花瓣;在结铃期,嫩叶与棉蕾中的Bt杀虫蛋白含量高于花瓣与幼铃。研究结果说明转Bt基因棉花Bt杀虫蛋白的表达水平受棉花器官种类、棉花生育期、棉花品种和种植年份的影响。

低温对转Bt基因棉杀虫蛋白表达及其氮代谢的影响

以2个转Bt基因抗虫棉,泗抗1号(常规种)、泗抗3号(杂交种)为材料,研究了低温对转Bt基因抗虫棉叶片中杀虫蛋白表达量和氮代谢的影响。2007年,于盛蕾期、盛花期、盛铃期,将盆栽棉花18℃低温下处理24 h。2008年,在18℃低温下处理48 h。研究结果表明,低温胁迫显著降低转Bt基因抗虫棉品种叶片中杀虫蛋白表达量。但盛铃期,下降幅度最大。其中低温胁迫24 h后,泗抗1号下降23.7%,泗抗3号下降28.1%;低温胁迫48 h后,2个品种分别下降52.9%和47.6%。叶片中丙酮酸转氨酶(GPT)活性、游离氨基酸、可溶性蛋白含量与蛋白酶活性在低温胁迫下表现相同趋势。以上结果表明,低温可能导致叶片可溶性蛋白的合成量降低,从而导致杀虫蛋白表达水平的下降。但对可溶性蛋白的分解并未有明显影响。

Cry1Ab杀虫蛋白在水稻-褐飞虱-拟水狼蛛食物链中转移与富集

采用ELISA方法检测了2个转 cry1Ab 基因水稻 (Bt水稻) 品系KMD1和KMD2不同生育期叶鞘内Cry1Ab杀虫蛋白的含量及其通过褐飞虱和拟水狼蛛的转移和富集情况。结果表明, 这2个品系中抽穗期和黄熟期叶鞘内Cry1Ab的含量均显著低于苗期、分蘖期和孕穗期, KMD1和KMD2中Cry1Ab杀虫蛋白可以通过食物链转移到Bt水稻非靶标害虫褐飞虱及其天敌拟水狼蛛体内。褐飞虱在KMD1或KMD2上取食2 d后, 体内均含有 Cry1Ab杀虫蛋白, 但连续取食2、4、6、8和10 d后,其体内含量并未因取食时间的延长而呈现明显增加的趋势。当拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时, 在捕食2、4、6、8和10 d后, 其体内均可检测到Cry1Ab杀虫蛋白, 其含量并未随捕食时间的延长而明显上升, 但均显著高于相应时间褐飞虱体内的含量。可见, 该蛋白可通过水稻转移至褐飞虱, 再转移至拟水狼蛛, 并存在明显的富集现象, 而这种富集并不随蜘蛛捕食时间的延长而加强。拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时, 其捕食量未受到显著影响, 其中肠酶粗提物对Cry1Ab杀虫蛋白具有明显的降解作用。

抗虫棉Bt杀虫晶体蛋白免疫检测方法的研究

抗虫棉Ｂｔ杀虫晶体蛋白免疫检测方法的研究Ｅｎｚｙｍｅ┐ｌｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｏｆＢａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎ┐ｇｅｎｓｉｓＩｎｓｅｃｔＣｏｎｔｒｏｌＰｒｏｔｅｉｎａｓＥｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＣ...

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5，对218株Bt菌株进行PCR鉴定，有51株含有vip3A类基因，其中12株为不同亚种的标准菌株，有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因，并插入表达载体pET—21b，转化大肠杆菌BL21，诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白，表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性，LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg，对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列)，杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低，说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。