隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析

目的 建立用巢式聚合酶链反应 (NestedPCR) 限制片段长度多态性 (Restrictionfragmentlength polymor phism ,RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫 (Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫 (C .andersoni)的方法。 方法 用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C .parvum与C .andersoni的Small SubunitrRNA (SSUrRNA)部分基因 ,并克隆和测序。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切 ,进行RFLP分析 ,并与GenBank上的 17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析。 结果 C .parvumHCC1、C .parvumBOCC1和C .andersoniBOCC1扩增产物片段大小分别为 83 0bp、83 0bp和 82 8bp ,经SspⅠ和VspⅠ分别单酶切后形成 2种不同的RFLP图谱 ,根据RFLP图谱可鉴别C .parvum与C .andersoni。序列分析结果显示 ,C .parvumHCC1与国外牛源C .parvumBOH 6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.3 % ;C .parvumBOCC1与国外牛源C .parvumBOH6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.5 % ;C .andersoniBOCC1与国外C .andersoni相应序列同源性为 99.9%。系统发育分析结果显示 ,隐孢子虫虫种形成了 2个群 ,1个群包括C .parvum、C .baileyi、C .meleagridis、C .felis和C .wrairi,另 1个群包括C .