玉溪霍尔多巴吉鹅感染贝氏隐孢子虫的分子鉴定

为了对云南省玉溪市某养殖场的霍尔多巴吉鹅进行隐孢子虫检测,本试验采集疑似感染隐孢子虫的霍尔多巴吉鹅的粪便样品,利用饱和盐水漂浮法进行镜检,并结合分子生物学鉴定方法,提取粪便样品DNA,采用巢氏PCR扩增隐孢子虫核糖体小亚基RNA(SSU rRNA)基因,测序后通过NCBI进行Blast在线比对,构建系统发育进化树。结果显示,所采集的鹅粪便样品中,隐孢子虫检出率为20.45%(9/44);隐孢子虫SSU rRNA基因的PCR扩增结果显示,该鹅源隐孢子虫与贝氏隐孢子虫同源性达100%;系统进化分析显示,二者位于同一分支。结果表明,该养殖场的霍尔多巴吉鹅存在贝氏隐孢子虫感染。

贝氏隐孢子虫内生发育虫体的扫描电镜观察

贝氏隐孢子虫内生发育各阶段虫体寄生于气管和法氏囊的微绒毛丛中 ,鸭对贝氏隐孢子虫的易感性低于鸡和丝毛乌骨鸡。滋养体呈球形 ,平均直径 1 3μm ;typeⅠ裂殖体 ,平均直径 2 4μm～ 3 0 μm ,内含 8个裂殖子 ,呈逆时针旋涡状或呈桔瓣状排列 ;typeⅡ裂殖体内含 4个裂殖子 ,两种类型裂殖体的裂殖子之间填充着颗粒状残体并包围着一个大的球形残体。成熟裂殖子逸出的方式分为 4种类型。裂殖子大小为 3 0× 0 6 μm ,呈香蕉形。大配子体呈球形直径 3 3μm～ 4 2 μm ,小配子体直径为 3μm～ 3 6 μm。小配子呈子弹状 ,大小为 1 2 μm× 0 3μm ,并观察到成熟小配子的释放方式。带虫空泡可分为无球形残体和有球形残体两类 ,根据观察结果推测带虫空泡基部的梳状结构不具备营养器官的功能 。

贝氏隐孢子虫对丝毛乌骨鸡的致病性试验

２ 日龄丝毛乌骨鸡经口接种贝氏隐孢子虫（ Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｂａｉｌｅｙｉ）卵囊２×１０６ 个／只，潜隐期４ｄ，排卵囊开放期１８ｄ，排卵囊高峰期为感染后（ Ｐ Ｉ Ｄ）７～１４ｄ。呼吸道症状出现于 Ｐ Ｉ Ｄ１０，死亡率为１３３％ （２／１５）。扫描电镜观察发现气管纤毛脱落，寄生有各阶段发育虫体及杆形细菌和渗出的红细胞；法氏囊也寄生有大量虫体，粘膜上皮细胞肥大，微绒毛脱落， Ｐ Ｉ Ｄ２０ 在法氏囊粘膜表面见有许多虫体逸出后留下的带虫空泡。试验证明丝毛乌骨鸡为贝氏隐孢子虫的新宿主。使用扫描电镜系统观察了贝氏隐孢子虫感染引起的组织形态学病理变化。

贝氏隐孢子虫在北京鸭体内发育的超微结构研究

贝氏隐孢子虫各期虫体均位于宿主粘膜上皮细胞的带虫空泡中。在虫体与上皮细胞接触处,虫体表膜反复折迭形成营养器。子孢子或裂殖子与粘膜上皮细胞接触后,逐步过渡为球形的滋养体;滋养体经2—3次核分裂、产生含4或8个裂殖子的两代裂殖体,裂殖体以外出芽方式产生裂殖子;裂殖子无微孔,顶端表皮形成3—4个环嵴,裂殖子进一步发育成为配子体;大配子体含有两种类型的成囊体。小配子呈楔形,无鞭毛和顶体,有一个致密的长椭圆形细胞核,小配子表膜内侧有9根膜下微管;孢子化卵囊内含四个裸露的子孢子和一个大残体。本文是有关鸭体内隐孢子虫超微结构的首次报导。

不同禽源贝氏隐孢子虫分离株对鹌鹑致病性的比较研究

本研究旨在观察不同禽源贝氏隐孢子虫（Cryptosporidium baileyi）对鹌鹑的致病性差异。采用光镜、扫描电镜等技术研究了鸡源、鸭源、鹌鹑源、白文鸟源、鸵鸟源贝氏隐孢子虫分离株对10日龄鹌鹑的致病性。结果表明,感染鹌鹑均出现腹泻和呼吸道症状,排卵囊持续期11~18 d,虫体寄生于喉头、气管、法氏囊和泄殖腔。其中鸭源C.baileyi感染组鹌鹑发病率和死亡率分别为82.5%、25%,鸡源C.baileyi（郑州株）感染组发病率和死亡率分别为77.5%、12.5%,鹌鹑源C.baileyi感染组发病率、死亡率分别为37.5%和17.5%。本研究结果提示,不同禽源C.baileyi对鹌鹑有一定致病性,其致病性强弱存在差异。

间接ELISA法检测贝氏隐孢子虫特异性IgY抗体的研究

应用蔗糖密度梯度离心法纯化贝氏隐孢子虫卵囊,冰浴超声波破碎、反复冻融卵囊,低温离心获得贝氏隐孢子虫卵囊蛋白质抗原.免疫产蛋鸡,6次免疫后获得高免特异性卵黄抗体IgY.制备辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗鸡IgG,其最佳工作浓度为1∶4 000-1∶6 000,贝氏隐孢子虫卵囊抗原包被浓度8.15 mg.L-1,4℃包被过夜（≥10 h）;1×106mg.L-1BSA-PBST稀释卵黄,建立了检测抗贝氏隐孢子虫特异性卵黄抗体的间接ELISA方法.

贝氏隐孢子虫单克隆抗体的研究

作者采用杂交瘤技术获得两株分泌贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)特异性抗体的杂交瘤细胞-2H_11和2C_7。经3～4次克隆化后,阳性率均达100%。染色体数分别平均为94和95。经分析:两株单克隆抗体识别抗原分子区的相关位点。为今后进行贝氏隐孢子虫的诊断及免疫学研究奠定了基础。

贝氏隐孢子虫PCR检测试剂盒的研制

目的研制禽类贝氏隐孢子虫的PCR检测试剂盒。方法根据贝氏隐孢子虫18SrRNA和ITS-1序列,选取遗传标记位点最多的一段核苷酸序列作为特异PCR引物的靶序列,设计、合成了一对针对贝氏隐孢子虫的特异性引物(YJWF:5’-ACTGATATACAATACCACGG-3’和YR:5’-GCGGATAAAGTTCAGGTTC-3’),对PCR反应条件进行了一系列优化,并分别对试剂盒的特异性、敏感性、稳定性、重复性和保存期等进行了系列研究。结果该试剂盒能特异性地扩增出贝氏隐孢子虫基因组中相应片段,与安氏隐孢子虫,微小隐孢子虫,柔嫩艾美尔球虫等相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到3.48个卵囊;反复冻融50次对试剂盒没有影响;室温条件下至少可保存4个月。结论该试剂盒的各项指标达到了贝氏隐孢子虫的检测要求。

贝氏隐孢子虫不同感染剂量对樱桃谷鸭的致病性

为了确定贝氏隐孢子虫对鸭的致病性,本试验分为2×105、4×105、8×105、16×105、32×105、64×105个卵囊剂量组,实验感染2日龄樱桃谷品种雏鸭。从感染鸭的排卵囊情况、临床症状、组织病理学变化、病理形态学变化比较了不同剂量组的致病情况。结果表明,贝氏隐孢子虫主要引起呼吸困难症状,气管炎和法氏囊炎病变。其致病性与剂量有明显的相关性。贝氏隐孢子虫有较强致病性,而且病程较长,但其致死率较低。

贝氏隐孢子虫在丝毛乌骨鸡体内发育的扫描电镜观察

使用扫描电镜观察了贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi) 在丝毛乌骨鸡体内内生发育虫体的三维形态。大量球形虫体嵌于微绒毛丛中。滋养体呈球形,直径1.54～1.76 μm 。裂殖体呈桔瓣形或旋涡形排列,直径2.4～3.0 μm ,内含8 个香蕉形裂殖子,大小为4 μm ×0.65 μm 。成熟大配子体直径为3.5 μm 。带虫空泡内、外侧基部均可观察到梳状结构,根据带虫空泡的结构将其分为2 类,其中一类为裂殖子或小配子的带虫空泡,另一类为卵囊的带虫空泡。

贝氏隐孢子虫在鸡体内发育的形态学特征及其对寄生器官的影响

取 2日龄海兰雏鸡 5 0只 ,分为 5组 ,分别接种 0、 0 8× 10 6、 1 6× 10 6、 3 2× 10 6、 6 4× 10 6个鸭源贝氏隐孢子虫 (Cryptosporidiumbaileyi)卵囊。接种后在不同的时间间隔内剖杀雏鸡 ,取法氏囊、气管和喉头。扫描电镜观察发现贝氏隐孢子虫主要寄生在鸡的喉头、法氏囊、气管。裂殖体有 2种类型 :Ⅰ型裂殖体含 8个裂殖子 ,Ⅱ型裂殖体含 4个裂殖子。子孢子或裂殖子在钻入过程中 ,虫体逐渐由香蕉形过渡到鼓槌形 ,最后形成球形的滋养体。带虫空泡分为有球形残体的带虫空泡和无球形残体的带虫空泡。观察到小配子的释放和虫体寄生于杯状细胞的现象。贝氏隐孢子虫寄生于气管引起纤毛倒伏、排列紊乱、纤毛融合、脱落 ;致使法氏囊上皮肿胀 ,法氏囊粘膜表面形成皱褶 ,微绒毛脱落、融合、排列紊乱 ,粘液性分泌物增多 。

2株贝氏隐孢子虫鸡源分离株对雏鸡的致病性比较

为了解不同地区鸡源贝氏隐孢子虫的致病特点，对收集到的郑州、林州两地区鸡源贝氏隐孢子虫卵囊经雏鸡传代扩增纯化后，分别以1×10^6个卵囊量接种3日龄罗曼公雏鸡，从其排卵囊情况、临床症状和病理学变化比较了2个分离株的致病情况。结果表明：2个隐孢子虫分离株均主要引起雏鸡呼吸道症状和法氏囊炎病变；接种雏鸡均于感染后第4天开始排卵囊，林州株和郑州株排卵囊持续期分别为23d和13d；排卵囊高峰期均为感染后第8～12天。雏鸡感染2个地区鸡源贝氏隐孢子虫分离株后，排卵囊量及排卵囊规律存在差异。

贝氏隐孢子虫鸡胚培养方法研究

目的建立能稳定获得大量贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)卵囊的鸡胚培养方法,应用于抗隐孢子虫药物筛选和C.baileyi体外传代培养研究。方法研究鸡胚培养温度、卵囊接种量、卵囊脱囊处理和卵囊回收时间对C.bai-leyi卵囊在鸡胚中增殖量的影响。结果 C.baileyi卵囊经尿囊腔接种9日龄鸡胚后在37℃、38℃、40℃条件下培养168h,各组鸡胚尿囊液中卵囊量差异不显著(P>0.05),但随着培养温度升高卵囊增殖量呈增加趋势。卵囊接种量分别为3.0×105个/枚和1.0×106个/枚,鸡胚40℃培养168h,尿囊液中卵囊增殖倍数差异不显著(P>0.05)。接种3.0×105个卵囊和等量卵囊脱囊后产物,鸡胚40℃培养168h,尿囊液中卵囊量差异不显著(P>0.05)。接种3.0×105个卵囊,鸡胚40℃培养168h,尿囊液中卵囊量显著高于接种后144h和接种后192h(P<0.05)。结论尿囊液收集时间是影响C.baileyi鸡胚培养卵囊获得量的重要因素,培养温度和接种量以40℃和3.0×105个/枚为宜,而卵囊脱囊处理是不必要的。

贝氏隐孢子虫PCR诊断试剂盒的应用

运用首次研制的贝氏隐孢子虫PCR诊断试剂盒于2007年9月至2008年3月对广东省广州、佛山两地家禽的215份粪便样品进行了贝氏隐孢子虫感染的实际检测，并与常规检测方法，如饱和蔗糖溶液漂浮法、改良抗酸染色法进行了比较。结果显示，该试剂盒的检出率比常规检测方法提高了4.54—6.25个百分点。证实该试剂盒具有特异、敏感等优点，对开展隐孢子虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查具有重要的应用价值。

贝氏隐孢子虫生活史的超微结构研究

立文利用透射电镜观察了樱桃谷鸭贝氏隐孢子虫人工感染石歧杂鸡后法氏囊虫体生活史的超微结构。结果表明:各期虫体,除裂殖子、子孢子或小配子外,均寄生于微绒毛包围形成的带虫空泡内,但未与上皮细胞浆接触。在虫体和上皮细胞间存在附着带和营养器。成熟裂殖体具有8个或4个裂殖子、孢子化卵囊具有4个子孢子。裂殖子前端有顶泡、锥体前环、锥体、棒状体和微线。后端有致密体、粗面内质网、高尔基体和细胞核。但没有发现线粒体、多糖颗粒、微孔和膜下微管。大配子除具有1～4个成熟体和2种成囊壁颗粒外,还有多糖颗粒、粗面内质网和液泡。

贝氏隐孢子虫在珍珠鸡体内发育的扫描电镜观察

采用扫描电镜观察了贝氏隐孢子虫在珍珠鸡体内的发育。大量球形虫体镶嵌于气管和法氏囊微绒毛丛中。气管纤毛消失，微绒毛生发生融合。法氏囊粘膜表面可观察到宿主细胞突起，在突起的表面有数个虫体寄生。滋养体呈球状，平均大小为１．７μｍ。裂殖体拥有４个或８个香蕉状裂殖子。成熟大配子体大小为 ４.２ × ３．３μｍ，在其侧面可观察到锯齿状突起。偶尔能观察到卵囊，其表 面有一明显裂缝。虫体逸出后所留下的带虫空泡似弹坑状，根据其结构可将其分为两类，其中一类为裂殖子或小配子的形成场所，另一类为卵囊的形成场所。

贝氏隐孢子虫在珍珠鸡体内发育的透射电镜观察

采用透射电镜观察了贝氏隐孢子虫在珍珠鸡气管和法氏囊的发育。贝氏隐孢子虫各期虫体均在上皮细胞微绒毛所形成的带虫空泡内发育，虫体基部有一营养器。滋养体呈圆形，有一个细胞核。胞质中有发达的粗面内质网。裂殖体经２或３次核分裂，以出芽方式形成４或８个裂殖子。成熟的裂殖子呈香蕉形，大小为２．８５×０．７０μｍ，被双层膜。小配子体由滋养体发育而来，内含多个缺少核仁的细胞核，细胞核移向胞质浅层，并进入胞质突起成为小配子的细胞核。大配子内可观察到二种成囊体和大量多糖颗粒，并在其胞质的空泡内发现小配子类似物。孢子生殖也在带虫空泡内进行，最终形成一个大残体和４个子孢子。子孢子有一个细胞核，富含微线和多糖颗粒。

湖南鸡隐孢子虫感染情况调查及雏鸡人工感染试验

作者对湖南省５县（市）８个鸡场的３４８只鸡进行了隐孢子虫感染的调查，并用２５只雏鸡作了隐孢子虫的人工感染试验。调查表明：４个县（市）有鸡隐孢子虫感染，感染率为２．８～２５．０％，总感染率为１２．１％，其中２～４周龄鸡为３．６％，８～４０周龄鸡为１５．１％，伊莎鸡、ＡＡ鸡、罗曼鸡、艾维茵鸡、泰国肉鸡分别为２１．９％、１３．６％、９．１％、５．４％和０；１０只阳性鸡器官粘膜涂片检查盲肠、法氏囊、直肠的染虫率分别为１００％、６０％和４０％，气管、十二指肠和小肠中段未查到虫体。雏鸡人工感染试验表明：经鼻腔和眼结膜感染潜隐期均为５天；经口感染潜隐期为４天，第８～１９天排出卵囊数较多，第１２天排卵囊达到最高峰，显露期为２１天。

鸡源和鸭源贝氏隐孢子虫分离株对雏鸡的致病性比较研究

目的研究不同宿主来源贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)对雏鸡的致病性差异。方法分别应用鸡源、鸭源贝氏隐孢子虫分离株感染3d龄雏鸡,感染量为1×106个/只,对实验组雏鸡的排卵囊规律、临床症状、法氏囊指数、组织学病理变化进行了研究。结果鸡源贝氏隐孢子虫感染组雏鸡未出现死亡,发病率为25%,鸭源贝氏隐孢子虫感染组雏鸡发病率和病死率分别为35%和5%。结论不同源贝氏隐孢子虫均能引起雏鸡隐孢子虫病,但临床症状、排卵囊规律、法氏囊病变等存在差异。

抗贝氏隐孢子虫卵黄抗体的制备与鉴定

为分析抗贝氏隐孢子虫的免疫机制,本研究将纯化的贝氏隐孢子虫卵囊经处理后制备成免疫抗原,经鸡翅下及大腿内侧肌肉多点注射免疫6次150日龄产蛋海兰鸡,每次免疫间隔为15~20 d,以制备特异性抗贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)卵黄免疫球蛋白(IgY)。结果显示,初次免疫后第120天,IgY效价达到1∶25 600,经免疫荧光法鉴定可识别贝氏隐孢子虫卵囊。用间接ELISA和间接免疫荧光试验比较测定IgY抗体对贝氏隐孢子虫、牛安氏隐孢子虫、猪等孢球虫及猪弓形虫的抗原发现,得到的IgY抗体能特异性识别贝氏隐孢子虫。间接ELISA法测定不同温度、不同pH下IgY的活性发现,制备的IgY抗体具有较好的热稳定性和一定的耐酸、耐碱性。以上结果表明,贝氏隐孢子虫卵囊抗原免疫蛋鸡可制备高质量的特异性IgY抗体,这为进一步应用抗隐孢子虫特异性IgY抗体治疗与诊断隐孢子虫病奠定基础。