黄瓜单性结实果实酵母双杂交文库的构建及CsCML25互作蛋白的筛选

为研究黄瓜单性结实形成的分子调控机制,以黄瓜单性结实自交系‘EC1’为材料,分别取开花前1 d至开花后4 d的子房,提取RNA后等量混合,采用SMART方法构建酵母双杂cDNA文库。结果表明,构建的文库总克隆数为1.16×107 CFU,平均插入片段长度≥1000 bp,阳性率为100%,符合建库的标准,可用于后续的酵母双杂交筛选。以黄瓜单性结实关键调控因子CsCML25为诱饵,构建pGBKT7-CML25诱饵蛋白表达载体,经自激活活性分析及不同浓度3AT对诱饵蛋白自激活活性抑制效果分析,使用SD-TLH+20 mM 3AT平板可完全抑制诱饵蛋白自激活活性。利用酵母双杂交筛选构建的黄瓜单性结实果实cDNA文库,得到96个初始阳性克隆。利用DNA测序、BLAST分析以及酵母回转验证等方法,最终获得27个可能与CsCML25相互作用的候选蛋白,为从分子水平探究CsCML25调控黄瓜单性结实的机制提供了理论基础。

黄瓜有限生长调控基因CsCML25的启动子克隆及功能分析

[目的]本文旨在通过对黄瓜有限生长调控基因CsCML25启动子功能的研究,揭示该基因在黄瓜有限生长过程中的转录调控机制。[方法]以黄瓜自交系材料CCMC的叶片DNA为模板,克隆CsCML25上游的全长启动子序列,并对其顺式调控元件进行分析;构建CsCML25基因过表达载体以及CsCML25启动子驱动GFP报告基因的表达载体,通过农杆菌介导遗传转化法将其转化拟南芥后,观察过表达植株表型并利用荧光显微镜观察GFP的表达规律;采用RT-qPCR分析该CsCML25启动子驱动的GFP报告基因在IAA和6-BA处理后以及在调控拟南芥有限生长基因TFL1影响下的表达变化。[结果]CsCML25启动子全长2979 bp,包括4个MYB转录因子结合位点、1个WUS结合位点以及多个细胞分裂素、生长素和光响应元件。过量表达CsCML25基因能够造成拟南芥顶端花融合现象,形成与拟南芥突变体tfl1-13相似的有限生长表型。CsCML25启动子驱动GFP在茎尖分生组织、叶原基、花原基以及花瓣等组织部位表达。RT-qPCR结果表明:IAA和6-BA处理能够显著影响CsCML25启动子的转录激活功能;拟南芥有限生长突变体tfl1-13杂交试验显示,TFL1的失活会降低CsCML25启动子驱动GFP表达的能力。[结论]CsCML25基因是调控有限生长的关键基因,在茎尖分生组织和幼嫩器官中特异性表达,其启动子转录活性受细胞分裂素和生长素的抑制;突变体杂交试验也证明有限生长调控基因TFL1可能通过调控CsCML25启动子的转录活性,进而影响植株的形态建成。