用改良CsCl密度梯度离心法提取石蒜叶片和鳞茎总RNA

The total RNA is extracted from leaf and bulb of Lycoris radiata(L’Hér.)Herb.by an improved method of CsCl density gradient centrifugation.The suitable amount of initial sample is 1.0 g.In order to remove impurities and purify the total RNA,the crude extract of RNA dissolved in lysis buffer is extracted with the mixed solution of chloroform and isoamyl alcohol(V ∶V,24 ∶1),then the total RNA is precipitated.The purity,integrity and quality of the total RNA are detected by ultraviolet spectrophotometer,agarose gel electrophoresis and RT-PCR method,respectively.The results show that polysaccharide can be removed effectively from the total RNA extract by the improved method of CsCl density gradient centrifugation.The purity andintegrityof the total RNA of L.radiata are better,and the ratio of A260/A280 is 1.85-2.00.It is concluded that the total RNA of L.radiata bulb extracted by the improved method can satisfy the demand of molecular biology experiments.

浮游板优化精液与密度梯度离心结合上游法的比较

目的应用浮游板和密度梯度离心结合上游法优化人类精液,明确优化效果并比较两种方法优化后精子参数的差异。方法收集正常精液样本85例和轻中度少弱精子症精液样本59例,每例样本分为原液组、密梯组和浮游组各1 ml进行后续处理。原液组在精液液化后未做任何处理;密梯组精液液化后用密度梯度离心法结合上游法进行处理,浮游组则在精液液化后应用精子浮游板进行处理。比较原液组、密梯组、浮游组3个亚组间的精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率;应用流式细胞仪检测精子线粒体膜电位和精子DNA碎片指数,使用单精子活性氧分析仪检测单精子活性氧水平,使用电子显微镜观察精子超微结构并进行组间比较。结果无论是正常精液还是轻中度少弱精子症精液,与原液组比较,密梯组与浮游组的前向运动精子百分率、正常形态精子百分率及精子线粒体膜电位均显著升高(P<0.05),精子DNA碎片指数显著降低(P<0.05);密梯组和浮游组各指标无显著性差异(P>0.05)。正常精液中,浮游组的精子浓度显著高于密梯组(P=0.029),单精子活性氧水平显著低于原液组(P=0.038)。轻中度少弱精子症精液中3亚组间的单精子活性氧水平均无显著性差异(P>0.05)。电子显微镜观察发现正常精液中3个亚组的精子均未见明显异常;轻中度少弱精子症精液中密梯组部分精子可观察到精子细胞膜断裂和线粒体肿胀等异常,而浮游组精子超微结构未见明显异常。结论密度梯度离心结合上游法和浮游板法用于精液的处理和优化,均可有效回收活力、形态和功能更好的精子。精子浮游板法的体外干预小,操作简便,可以获得活性氧更少、损伤更小的精子。

密度梯度离心法对辅助生殖患者精子DFI的改善作用及精子DFI与AIH妊娠率的相关性研究

目的分析密度梯度离心法对行夫精人工授精(AIH)患者精子DNA碎片率(DFI)的改善作用,以及精子DFI与AIH妊娠率的相关性。方法选取2019年9月至2021年10月在内蒙古自治区妇幼保健院实施AIH治疗患者的320个周期作为研究对象,采用流式细胞法获得密度梯度离心法优选前后的精子DFI,并进行统计学分析。结果AIH周期患者精子DFI异常(≥15%)率为25.94%;精子优选处理后DFI得到了显著改善(P<0.01),经密度梯度离心法处理后DFI≥15%的精液标本占比从25.94%下降到了9.07%,经随访95.24%的妊娠个案来自优选处理后精子DFI<15%的分组。结论密度梯度离心法对精子的DFI有显著改善作用;AIH周期的男性患者处理前精子DFI与该周期妊娠率无显著相关性;优选处理后较低精子DFI对应较高的妊娠率,优选处理后的精子DFI对患者的妊娠结局更有预测价值。

密度梯度离心法分离精子在宫腔内人工授精中的应用

目的:探讨密度梯度离心法应用于宫腔内人工授精的精子分离时精子指标的变化及精子形态对回收率的影响。方法:选择2008年9-10月间所有进行宫腔内夫精人工授精的51份精液,采用密度梯度离心法分离精子,记录精子分离前后的各项指标,计算回收率并作统计分析。结果:(1)精子存活率由(53.63±15.94)%提高至(88.75±9.69)%(P<0.05),平均回收率为(25.84±16.57)%。(2)正常形态精子比例由9%提高至18%(P<0.05),各类畸形精子均显著减少,尤其颈部和尾部畸形的精子减少最为明显。(3)根据处理前精子正常形态的比例分为≤4%、5%～14%、≥15%3组,分离后精子存活率分别为(80.45±14.05)%、(91.32±7.30)%、(90.00±4.33)%(P=0.004),回收率分别为(19.67±10.49)%、(28.51±16.87)%、(41.14±15.02)%(P=0.013)。精子正常形态比例与回收率呈正相关(r=0.456,P=0.001)。结论:密度梯度离心法可以有效回收活力好、形态正常的精子,对于去除颈部和尾部畸形的精子效果更好,精子正常形态与回收率呈正相关。

应用密度梯度离心法分离扩增兔骨髓基质细胞的体会

目的 探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞 (BMSc)的条件 ,为组织工程学选择合适的种子细胞奠定基础。方法 采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离并培养 ,观察其增殖和生长特性 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率。结果 兔BMSc在第 7代前性状稳定 ,生长曲线相似 ;第 4天分裂指数最高为 15 % ;传代后 10h贴壁率高达 90 %。结论 密度梯度离心法是分离兔BMSc的理想方法 ,BMSc能为未来组织工程提供足量种子细胞。

Ficoll密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞条件的探讨

目的探讨猪外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,为寄生虫免疫学研究提供有效的方法。方法使用猪淋巴细胞分离液,在不同离心转速和时间条件下分离猪PBMC,观察所得云雾状PBMC层的厚度,计算细胞得率及细胞活力,以确定猪淋巴细胞分离液分离猪PBMC的最佳实验条件。同时采用文献报道的人淋巴细胞分离液分离猪PBMC的分离条件(1500r/min,30min)分离猪PBMC,比较两者分离PBMC效果。结果使用猪淋巴细胞分离液(密度1.110ng/L),在20～25℃室温下以1500r/min(半径15cm)离心30min,接着低温(4℃)1500r/min离心10min,洗涤2次,这样获得的猪PBMC效果最好。同样条件下,用人的淋巴细胞分离液分离猪PBMC,不仅所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较多,而且PBMC细胞得率及活力也不好。结论本实验提出了获得大量有活力的猪PBMC的方法和条件。

犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化：Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性

背景:目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法,以去除血细胞成分,但该法操作较为复杂,分离犬骨髓时需要配制密度,且离心次数较多,对细胞损伤大。目的:拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法,并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力。方法:于犬髂后上棘抽取骨髓液10mL,肝素抗凝,Hanks液稀释后,加入1.077g/mL Ficoll液3mL,2000r/min离心20min,吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面,用含胎牛血清的DMEM离心2遍,按12×104/cm2密度接种,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养。细胞传代后,加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导。免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达,以及Ⅰ型胶原的表达,并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色。结果与结论:1.077g/mLFicoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显,可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,接种细胞生长良好,平均倍增时间为24h。犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后,骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色,茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节,可在体外定向分化为成骨细胞。

应用单层和双层密度梯度离心法处理男性不育症患者精液效果对比

目的评价单层和双层密度梯度离心法处理男性不育症患者精液并行宫腔内人工授精(artificial insemination with husband′s sperm,AIH IUI)的应用效果。方法连续收集在本中心施行IUI手术的男方精液标本500份,随机采用70%单层法(正常精子45份、轻度少精子症90份、轻度弱精子症90份)或90%+45%双层法(正常精子55份、轻度少精子症110份、轻度弱精子症110份)进行密度梯度离心,优选前后均进行精子质量和功能检测,并随访妊娠结局。结果经单层法优选后,正常精子组前向运动精子百分率(PR)和PR精子回收率低于双层法,轻度少精子症组精子总活力[PR+非前向运动镜子百分率(NP)]和PR+NP精子回收率高于双层法(均P<0.05);轻度弱精子症组经两种方法优选后,PR和PR+NP精子回收率高于正常精子组和轻度少精子症组(P<0.05);3组精液经两种方法优选后,正常形态精子百分率、诱发顶体反应(AR)率、DNA碎片化指数(DFI)、精子成熟度和精液白细胞浓度与处理前差异均有统计学意义(P<0.05);研究时间段内采用来曲唑(LE)促排方案的334个周期临床妊娠率,单层法68周期,正常精子15.38%,轻度少精子症14.81%,轻度弱精子症17.86%;双层法266周期,正常精子13.21%,轻度少精子症14.15%,轻度弱精子症15.89%(均P>0.05)。结论单层和双层密度梯度离心法均能筛选较高质量的精子,应根据不同病因患者的精液情况选用合适的优选方法。

密度梯度离心法与直接上游法优化处理精液对宫腔内人工授精临床妊娠率的影响

目的:应用密度梯度离心法和直接上游法处理不明原因不孕和轻度精液异常患者的精液,比较两种方法对宫腔内人工授精(IUI)临床妊娠率的影响。方法:回顾性分析2013年1月至2014年12月期间,在我中心进行促排卵+IUI的571个周期患者,统计其精液优化处理方法和临床妊娠率。结果:总体临床妊娠率为密度梯度离心法(17.8%)显著高于直接上游法(11.4%)(P<0.05);不明原因不孕组的临床妊娠率为密度梯度离心法(33.7%)显著高于直接上游法(20.3%)(P<0.05);轻度精液异常组的临床妊娠率为密度梯度离心法(11.6%)显著高于直接上游法(7.6%)(P<0.05)。结论:密度梯度离心法相对直接上游法能有效提高因不明原因不孕和轻度精液异常患者IUI的临床妊娠率。

用蔗糖密度梯度离心法纯化小球隐孢子虫卵囊试验

用蔗糖密度梯度离心法从接种犊牛粪便中纯化小球隐孢子虫卵囊 ,该方法操作简便、快速、经济、获得的卵囊纯度高 ,回收率达 92 .0 % ,适合于国内普通实验室使用。

宫腔内人工授精中应用上游法和密度梯度离心法的系统评价

背景:精子体外优选方法很多,最常见的是上游法和密度梯度离心法。采用何种方法来减少体外处理过程对精子的不良刺激,优选出具有良好受精潜能的精子,目前尚无定论。目的:系统评价上游法和密度梯度离心法在宫腔内人工授精中的应用,比较两种精子优选法的优劣。方法:计算机检索PubMed、Cochrane Library、EMBASE等数据库,手工检索专业相关期刊,检索时间为1966-01/2009-02。纳入关于两种精液优选法在宫腔内人工授精中应用的随机对照试验或半随机对照试验,评价纳入研究的方法学质量,并提取有效数据用RevMan5.0.软件进行Meta分析。结果与结论:纳入6个研究,包括4个随机对照试验和2个半随机对照试验,共486例患者,1099个周期(优选精子的次数)。Meta分析结果显示,上游法与梯度离心法相比,周期妊娠率[OR=1.11,95%CI(0.8,1.55)]、流产率[OR=0.31,95%CI(0.09,1.04)]、精子密度[WMD=-0.89,95%CI(-14.17,12.38)]、精子活力[WMD=-2.31,95%CI(-7.27,2.65)],4项测量指标差异均无显著性意义。尽管与其他精子优选法相比,上游法与梯度离心法的周期妊娠率较高,但是该系统评价结果还不能提示这两种方法在宫腔内人工授精应用中何者临床效果更好。建议今后进行更多高质量的随机双盲对照试验为临床提供最佳证据,并且增加处理前后精子的质量对比,包括精子活力、精子密度以及精子功能等指标测量,以全面考察两种方法的优劣。

密度梯度离心法加上游法处理精液对精子运动参数及形态学的影响——附102份标本分析

目的:了解密度梯度离心法加上游法处理精液对精子各运动参数和形态学的影响。方法:采用密度梯度离心法加上游法处理102份男性精液标本,应用计算机辅助精液分析系统软件分析精子各项运动参数,并运用改良巴氏染色法观察精子形态。结果:经密度梯度离心法加上游法处理后,精子活动率、活动力、曲线速度、直线速度等运动参数值均明显提高(均为P<0.01)。经该法处理后,畸形精子百分率、精子畸形指数均明显降低(均为P<0.01)。结论:密度梯度离心法加上游法可使精子的运动参数及形态学均得到明显改善,是较好的体外处理精液方法。

密度梯度离心法分离脐血干细胞:分离介质的筛选

背景:应用脐血分离干细胞的目的是获得以干细胞为主要群体的单个核细胞群,密度梯度离心法是最简单有效的方法之一。密度梯度离心法使用的分离介质以聚蔗糖泛影葡胺最为常用,但哪种浓度获得干细胞最多,目前尚未深入研究。目的:探讨密度梯度离心法分离人脐血干细胞分离介质的最佳浓度,建立临床级干细胞分离应用方案。方法:采用两步法分离脐血流程,先用羟乙基淀粉沉淀脐血红细胞,再使用质量浓度分别为(1.0730±0.0001),(1.0750±0.0001),(1.0770±0.0001)g/mL的分离液,分离沉淀脐血红细胞后的上清液,得到单个核细胞,分别计数细胞获得率及细胞存活率。采用流式细胞仪测定单个核细胞表面标志物,将各亚组分绘制成直方图或散点图,分析所得脐血单个核细胞中所含单个核细胞亚组分的比例和绝对数量。结果与结论:应用质量浓度(1.0730±0.0001)g/mL的分离液可得到最大比例间充质干细胞群,是分离间充质干细胞的最佳质量浓度。使用质量浓度(1.0750±0.0001)g/mL的分离液可得到较高比例的造血干细胞群,是分离造血干细胞的最佳质量浓度。使用质量浓度(1.0770±0.0001)g/mL的分离液得到细胞总数最高,但获得的间充质干细胞、造血干细胞比例最低。采用两步法分离干细胞流程,建立严格的实验室条件和标准,可获得密度梯度离心法分离人脐血干细胞的最佳分离方案。

密度梯度离心法检测脱落肿瘤细胞对恶性胸腔积液的诊断价值

胸腔积液是临床常见征象，其良恶性质的鉴别是临床上尚未解决的难题之一．本试验对３６例恶性胸腔积液，３０例结核性胸腔积液分别用密度梯度离心法、常规离心涂片法检测脱落肿瘤细胞，并对其中２２例恶性胸液患者行胸膜活组织检查．结果密度梯度离心法之脱落肿瘤细胞检出率为９１．７％，常规离心涂片法检出率为４４．４％，针刺胸膜活检法检出率为４０．９％，常规离心涂片联合针刺胸膜活检的检出率为５４．５％；密度梯度离心法对脱落肿瘤细胞的检出率明显高于常规离心涂片法（ｐ＜０．００５）或／和胸膜活检法（ｐ＜０．００５），且无假阳性．表明用密度梯度离心法检测胸液脱落肿瘤细胞是一阳性率高且简便实用的特异性方法。

密度梯度离心法收集逆行射精患者尿液中精子用于人工授精

目的:探讨密度梯度离心法收集逆行射精患者尿液中的精子用于人工授精的可行性。方法:碱化患者尿液,应用两层密度梯度离心法收集尿液中的精子,在配偶排卵期内行宫腔内人工授精。结果:5例逆行射精患者,在经过共18次收集尿液中精子及对配偶实施人工授精术后,有3例成功妊娠并有2例已足月分娩。结论:密度梯度离心法收集逆行射精患者尿液中的精子,方法简单、快捷有效,用于人工授精具有可行性。

免疫磁珠法及密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的比较

目的比较免疫磁珠法和密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的可靠性。方法用免疫磁珠法和密度梯度离心法分别分离中性粒细胞,使用血球计数仪结合显微镜鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力。结果免疫磁珠法与密度梯度离心法分离中性粒细胞纯度分别为(98.76±0.53)%,(92.34±1.57)%,回收率分别为(90.01±2.24)%和(82.20±2.17)%,两种方法分离后中性粒细胞活力分别为(95.60±2.30)%,(94.20±3.11)%。结论免疫磁珠法分离人中性粒细胞纯度及回收率均好于密度梯度离心法,但分离后细胞活性二者差异不大。

密度梯度离心法联合上游法处理精液对精子功能的影响

目的分析密度梯度离心法联合上游法处理精液对精子功能的影响。方法 200份精液标本作为研究材料,根据材料编号不同随机分为对照组与实验组,各100份。对照组使用密度梯度离心法进行精液处理检测,实验组使用密度梯度离心法联合上游法进行精液处理检测,比较两种检测方法对精子功能的影响。结果实验组样本存活率、活力以及形态均显著优于对照组,精子DNA碎片率明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组样本精子DNA碎片指数(DFI)、高可染性精子指数(HDS)水平分别为(22.57±4.46)%、(13.89±2.24)%,均明显优于对照组的(13.21±3.18)%、(8.12±2.59)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论密度梯度离心法联合上游法具有较好的精液处理能力,有利于提高精子的存活率,且不会造成精子DNA损伤,在精液处理中发挥出了较好的应用及推广价值。

密度梯度离心法处理逆行射精患者尿液内精子用于人工授精的临床效果观察

目的:探讨密度梯度离心法处理逆行射精患者尿液内的精子用于人工授精的可行性。方法:碱化患者尿液,应用两层密度梯度离心法处理尿液内的精子,在配偶排卵期内行宫腔内人工授精。结果:5例逆行射精患者,在经过共18次处理尿液内精子及对配偶实施人工授精术后,有3例成功妊娠并有2例已足月分娩。结论:密度梯度离心法处理逆行射精患者尿液内的精子,方法简单、快捷有效,用于人工授精具有可行性。

Nycodenz密度梯度离心法提取及纯化大鼠心肌线粒体

目的建立一种利用Nycodenz密度梯度离心法提取组织线粒体的方法。方法传统离心方法得到粗提线粒体后,在Nycodenz密度梯度介质中超高速离心得到纯化线粒体,进一步在经改良的线粒体分离介质中重复离心2次,得到高纯度的线粒体。利用透射电镜和Western Blot检测线粒体纯度。结果使用Nycodenz密度梯度离心法和线粒体分离介质提纯的线粒体量多、纯度较高(COXⅣ含量纯化组:粗提组=220%±26%vs.160%±34%,P<0.05),且电镜照片显示结构完整。结论使用Nycodenz密度梯度离心法可获得高纯度且结构较完整的线粒体。

优化的密度梯度离心法提取质粒DNA

质粒常被用做基因的载体．纯化质粒DNA的方法可以分为3种：碱裂解法、煮沸裂解法和SDS碱裂解法．这些方法可以纯化共价闭合环结构质粒DNA，而大量获得高纯度的闭环结构质粒DNA最经典方法是氯化铯．溴化乙锭密度梯度离心法．该方法经过我们的实践与优化，减少了质粒中蛋白质和基因组DNA的污染，提高了质粒的纯度和得率，所得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，效率高达60％～70％，明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒DNA．