柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。