甜橙CsLOB1基因克隆、表达及干涉载体构建

为探讨高感溃疡病‘纽荷尔’脐橙CsLOB1基因序列特征及其响应柑橘溃疡菌侵染表达特点,利用同源序列法从‘纽荷尔’脐橙叶片中克隆得到CsLOB1基因CDS全长并进行序列分析.实时荧光定量法检测‘纽荷尔’脐橙叶片接种溃疡菌后CsLOB1基因表达变化.结果表明,CsLOB1基因CDS序列全长714 bp,编码237个氨基酸.理化性质预测分析表明CsLOB1蛋白为亲水性蛋白质;保守域预测表明,CsLOB1蛋白含有LBD基因家族LOB保守结构域.系统进化树分析表明,‘纽荷尔’脐橙与克里曼丁橘CsLOB1蛋白同源性高于其它非柑橘类植物.实时荧光定量PCR分析显示,柑橘溃疡菌接种后,‘纽荷尔’脐橙叶片CsLOB1基因表达显著上调.采用gateway克隆技术进一步构建CsLOB1基因RNAi干涉载体,为柑橘抗溃疡病种质的创建建立基础.

CRISPR/Cas9介导柑橘CsLOB1基因启动子的多位点编辑

为了获得CsLOB1启动子较大片段删除的突变体,利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1启动子进行多位点编辑。通过在CsLOB1启动子的EBEPthA4区域及其上、下游设计不同的靶标位点,构建了2个植物表达载体pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites,分别对CsLOB1启动子同时进行2个位点和3个位点的编辑。测序结果表明pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites的基因编辑效率分别为64.7%和80.0%,突变体植株在2个sgRNA之间发生了DNA片段的删除。进一步的分析发现,不同的sgRNA具有不同的突变效率,其差异是由于不同的sgRNA对CsLOB1-识别和结合能力的差异造成的。本结果表明对CsLOB1启动子进行多位点编辑可以获得删除较大DNA片段的突变体。