茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3(登录号为KY865305),分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种(系)中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得Cs PAL3基因全长c DNA为2 518 bp,包含一个完整的2 130 bp开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40 k D,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现Cs PAL3与芒果的Mi PAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、Cs PALc、Cs PAL3(CsPALe)基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、Cs PALc、Cs PAL3(CsPALe)基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。

茶树CsPAL3基因的亚细胞定位及遗传转化

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。以紫化茶树武夷奇种C18为材料,采用Gateway技术体系分别构建了茶树的CsPAL3过表达载体pGWB502:CsPAL3和pGWB505:CsPAL3:GFP,并成功将其转入根癌农杆菌GV3101。注射烟草瞬时表达激光共聚焦扫描显微镜可观察到GFP绿色荧光,结果表明CsPAL3主要集中在细胞核和细胞膜中。通过侵染拟南芥,筛选纯合子,获得稳定表达的转CsPAL3基因拟南芥。实时荧光定量PCR(qPCR)检测发现,CsPAL3在转CsPAL3基因拟南芥中的根部表达量显著高于叶片,且CsPAL3基因受光照调控。该结果为进一步研究茶树CsPAL3基因功能以及促进茶树花青素合成与积累的分子调控机理提供科学依据。

茶树CsPAL3基因的启动子克隆及表达分析

通过染色体步移法克隆获得紫化茶树武夷奇种C18的CsPAL3基因启动子即5′端侧翼序列,采用软件Plant CARE在线分析该序列的顺式作用元件.选取生长势一致的茶树植株的第2叶位叶片,采用锡箔纸对其进行遮阴处理,另一部分以自然光照条件为对照,分别经过2、4、6、8、10 d的遮阴处理,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测茶树CsPALs基因家族成员的相对表达量在遮阴组和光照组的差异情况.结果表明,CsPAL3基因启动子序列为501 bp,除CAAT-box和TATA-box核心启动子元件之外,还包含光响应(G-box、I-box、Sp1等)、脱落酸响应(ABRE)、低温响应(TCA-element)、干旱胁迫响应(MBS)、茉莉酸甲酯响应(CGTCA-motif、TGACG-motif等)、热激响应(HSE)等环境胁迫相关的顺式作用元件.随着处理时间的增加,茶树CsPALs基因家族成员的相对表达量在遮阴组和光照组中均呈现下调趋势,且遮阴组的相对表达量下降趋势显著大于光照组,表明茶树CsPALs基因家族成员的相对表达量受光照调控.其中CsPALa、CsPALb、CsPALc和CsPALf在遮阴处理4 d的相对表达量降低最明显,CsPALd和CsPAL3均在遮阴处理2 d的相对表达量降低最明显.这可推测CsPALs基因家族成员受光照环境调控.

黄瓜苯丙氨酸解氨酶基因CsPAL的克隆及响应白粉菌侵染的表达分析

为了分析苯丙氨酸解氨酶基因(CsPAL)在黄瓜侵染白粉菌中的转录应答响应,对CsPAL基因(GenBank No.JN 675927)及其启动子进行了克隆与序列分析,再利用qRT-PCR技术分析了该基因在黄瓜高抗白粉病品种‘Jin5-508’接种白粉菌后不同时间的相对表达量。结果表明:CsPAL基因全长2 142 bp,编码713个氨基酸;推测CsPAL蛋白存在于细胞质中;系统发育进化树分析发现与拟南芥基因进化距离较近;启动子克隆及序列分析显示该基因能够响应真菌的侵染;组织特异性表达发现CsPAL在在叶片中的表达量最高;qRTPCR结果表明‘:Jin5-508’叶片在接菌16 h内,CsPAL基因的相对表达量于对照间无显著差异;接菌16 h后,CsPAL基因表达量迅速上升,显著高于对照,并在24 h达到最大值;接菌48 h后,CsPAL基因的表达量逐渐下降,但在96 h内仍显著高于相应对照的表达量。综上所述,黄瓜CsPAL基因为白粉菌侵染响应基因,可能与黄瓜对白粉病的抗性具有一定的相关性。