白念珠菌感染特异性Csa2蛋白双抗体夹心ELISA体系的建立与评价

目的以白念珠菌Csa2蛋白为靶标,建立双抗体夹心ELISA检测体系,评价该方法的检测灵敏度和特异性。方法构建pPIC9K-Csa2重组表达载体,电转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达、纯化重组蛋白rCsa2。rCsa2蛋白分别免疫新西兰大白兔和豚鼠制备免疫血清。以纯化兔多抗和豚鼠抗血清配对,利用棋盘滴定法,确定最佳实验条件,建立双抗体夹心ELISA检测系统。检测rCsa2和白念珠菌不同培养时间的上清,确定检测方法的灵敏度;检测其他3种念珠菌、5种曲霉、新型隐球菌和马尔尼菲青霉的培养上清,评价检测方法的特异性。结果成功构建表达载体并获得真核表达重组蛋白rCsa2,经SDS-PAGE鉴定相对分子质量(Mr)为13 300,符合预期值;Western blot法证实该蛋白可与特异性抗体结合。免疫动物获得高效价免疫血清,并以此成功建立双抗体夹心ELISA,可检测rCsa2蛋白的灵敏度约为240 pg/mL,并最早可检测到培养18 h的白念珠菌培养上清,与其他10种临床常见真菌的培养上清无交叉反应。结论建立了有较高的检测灵敏度和特异性的Csa2的双抗体夹心ELISA,为区别诊断白念珠菌感染提供新的方法。

白念珠菌Csa2蛋白双抗原夹心ELISA方法的建立及诊断价值

目的建立以白念珠菌Csa2蛋白抗体为靶标的双抗原夹心ELISA,初步评价其鉴别诊断白念珠菌尿道感染的应用价值。方法通过间接免疫荧光染色定位Csa2蛋白在白念珠菌菌体分布情况;应用棋盘滴度法优化反应条件,建立双抗原夹心ELISA并进行方法学评价;检测324例健康体检者血清,确定该方法的cutoff值;检测120例健康体检者及30例念珠菌属尿路感染患者血清,分析其诊断的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值。结果 Csa2蛋白是一种特异性分布在白念珠菌菌丝态表面的蛋白;以0.1 μg/mL的rCsa2蛋白为包被抗原,1∶1 000稀释的rCsa2-HRP蛋白为检测抗原,建立双抗原夹心ELISA,可最低检测1∶16 000稀释的rCsa2蛋白免疫兔血清并不与正常兔血清发生反应;该方法的cutoff值为0.072,诊断白念珠菌尿路感染敏感性为65.2%(15/23),特异性为98.4%(125/127),阳性预测值88.2%(15/17),阴性预测值为94.0%(125/133)。结论成功建立检测白念珠菌特异性Csa2蛋白抗体双抗原夹心ELISA;初步评价该方法对诊断白念珠菌尿路感染具有较高的特异性,得出较高阳性预测值和阴性预测值;Csa2抗体靶标对区分白念珠菌感染和定植具有一定价值。

合成肽VAR2特异性结合循环肿瘤细胞的检测及临床应用

目的探讨疟疾蛋白(VAR2)合成肽特异性结合循环肿瘤细胞(CTCs)的检测及临床应用。方法选择疟疾蛋白VAR2CSA功能结构域肽段序列合成VAR2多肽;基于纳米微流控技术富集CTCs,利用VAR2合成肽对富集细胞进行检测,建立一种新型CTCs检测方案。用细胞免疫荧光染色、流式细胞测量术及肿瘤细胞掺入回收实验,分析VAR2合成肽与不同组织来源肿瘤细胞特异性结合、回收效率,并与免疫荧光原位杂交(imFISH)检测法进行比较。选取22例结直肠癌患者与22名健康者,利用VAR2合成肽检测两者外周血CTCs。比较不同TNM分期患者CTCs阳性检出率。结果合成肽VAR2可以与人结肠癌细胞系SW620、人乳腺癌细胞系MCF7和人食管鳞癌细胞系KYSE180不同组织来源的肿瘤细胞特异性结合,合成肽VAR2检测100个SW620、MCF7、KYSE180肿瘤细胞掺入3 mL外周血中的回收率分别为82.8%±8.41%、56.2%±3.57%、86.6%±8.19%,与imFISH法检测法比较,差异无统计学意义。合成肽VAR2检测50、100、200个3种不同肿瘤细胞的回收率与掺入肿瘤细胞的数量没有明显相关性。合成肽VAR2检测临床结直肠癌患者外周血样本CTCs阳性率为63.6%,高于健康受试者组CTCs阳性率的0.0%,同时与侵袭深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期相关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论合成肽VAR2可实现对不同组织来源、非抗体依赖性的特异性CTCs检测,对于肿瘤患者临床分期、病情评估具有一定的临床应用价值。

基于STC12C5A60S2与AD620的小信号采集系统

在测控领域中,经常遇到监测对象输出信号较小,难以直接采集,一般都需要将其放大后再做处理。介绍了一种小信号采集系统的实现方法,利用具有A/D转换功能的单片机STC25A60S2和具有精确放大功能的易用放大器AD620实现了最小系统,并论述了系统设计与实现,详细介绍了采集小信号的过程,并给出了实际应用的例子,以及小信号采集在相关领域的应用。

妊娠相关性疟疾及其研究进展

恶性疟疾是对人类健康危害最为严重的传染病之一。生活在疟疾流行区的人随着年龄的增长和感染次数的增加会逐渐获得保护性免疫即临床免疫。然而,孕妇尤其是初孕妇女在妊娠过程中感染恶性疟原虫后往往呈现急性感染症状,甚至危及孕妇和胎儿的生命。妊娠相关性疟疾(pregnancy-associated malaria,PAM)主要是由于受恶性疟原虫感染的红细胞和单核细胞在胎盘绒毛间大量聚集引起的。大量的研究表明,黏附在子宫粘膜上的虫体表达一种具有特殊生物活性和抗原性的蛋白质(var2CSA)。Var2CSA可特异性地与子宫粘膜上的硫酸软骨素A(Chondroitin sulfateA,CSA)结合。此外,由于var2CSA的序列相对保守,机体在感染几次以后较容易产生交叉免疫保护反应。对PAM的研究是疟疾领域内的重要内容,目前在很多领域(病原学、分子致病机理、免疫学等)已经取得重要进展。本篇综述概括了近年来在PAM研究方面的进展,包括虫体表达的主要膜蛋白质的功能、相关的人体受体以及免疫学方面等内容。

恶性疟原虫海南株var2csa基因DBL区蛋白的原核表达及功能分析

目的克隆、表达恶性疟原虫海南株变异抗原基因(var)家族之一var2csa基因的血型抗原结合基团(duffy anti-gen-binding ligand,DBL)4、DBL5、DBL6区,比较其与硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)黏附能力的差异。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株基因组DNA中3个目的片段,将扩增产物与pMD18-T克隆载体连接,经酶切、测序鉴定正确后克隆至表达载体pET-22b上,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,并用组氨酸标签融合蛋白纯化柱(His GraciTrap)纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)检测目的蛋白。ELISA检测不同DBL区重组蛋白与CSA的结合情况。结果 PCR扩增获得目的片段分别为996、859和894bp,酶切及DNA测序结果均显示重组质粒构建成功,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达并纯化3个DBL区重组蛋白,DBL4区、DBL5区和DBL6区的相对分子质量分别为Mr 439800,Mr 34500,Mr 36000。West-ern blotting检测结果显示,目的蛋白具有反应原性。ELISA结果显示,不同蛋白浓度条件下DBL5区均明显比其他两个DBL区的吸光度(A405值)高(P<0.05),表明DBL5区与CSA的黏附能力较强。结论 var2csa基因3个DBL区重组蛋白表达成功,DBL5区与CSA的黏附能力较强。

疟原虫重组蛋白rVAR2及其在肿瘤靶向治疗中的应用进展

恶性肿瘤是造成人类死亡的主要原因之一,其发病率和死亡率逐年上升。靶向药物可精确作用于肿瘤,在近年来备受关注。特异性识别和广泛结合肿瘤细胞是实现肿瘤靶向治疗的关键,而目前缺乏高效特异的泛肿瘤靶向工具,这极大地限制了肿瘤靶向治疗的进一步发展。与现有的肿瘤靶向方式相比,疟原虫重组蛋白rVAR2能够特异性结合肿瘤细胞表面广泛表达的癌胚硫酸软骨素(oncofetal chondroitin sulfate,ofCS),具备泛肿瘤靶向的优点,为肿瘤靶向治疗提供了新思路。对rVAR2的特点及其近年来在肿瘤靶向治疗中的应用进展进行分析和总结,并对其未来发展方向进行了展望,以期为临床肿瘤靶向治疗及诊断方法的发展提供参考。

恶性疟原虫海南株var2csa基因的克隆、表达及免疫识别研究

目的克隆、表达恶性疟原虫海南株HN(2)var2csa基因DBL4、DBL5、DBL6区,通过ELISA方法比较其与硫酸软骨素A(CSA)的亲和能力差异,以及人体对恶性疟原虫海南株HN(1)、(2)VAR2CSA不同DBL区的免疫应答差异。方法根据DBL区序列设计3对引物,PCR扩增目的片段,并与pMD18-T克隆载体连接。经PCR、酶切、测序鉴定正确后克隆至表达载体pET-22b,通过转化、诱导、纯化表达重组蛋白质,SDS-PAGE和Western blot检测。通过ELISA方法进行重组蛋白质与CSA的粘附实验以及与患者血清的免疫识别实验。结果酶切及DNA测序结果均表明表达载体构建成功,表达并纯化3个DBL区重组蛋白质,分子量与预计大小相同,Western blott检测目的蛋白质具有免疫反应性,ELISA显示不同蛋白浓度条件下DBL5区均明显比其它两个DBL区有更高的OD405值,并且DBL5区被妊娠相关疟疾病人血清识别水平显著高。结论 var2csa基因3个DBL区重组蛋白质表达成功,DBL5区与CSA的粘附能力较强,人体对DBL5区的免疫应答反应可能在抗病免疫过程中起到关键作用。