白念珠菌感染特异性Csa2蛋白双抗体夹心ELISA体系的建立与评价

目的以白念珠菌Csa2蛋白为靶标,建立双抗体夹心ELISA检测体系,评价该方法的检测灵敏度和特异性。方法构建pPIC9K-Csa2重组表达载体,电转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达、纯化重组蛋白rCsa2。rCsa2蛋白分别免疫新西兰大白兔和豚鼠制备免疫血清。以纯化兔多抗和豚鼠抗血清配对,利用棋盘滴定法,确定最佳实验条件,建立双抗体夹心ELISA检测系统。检测rCsa2和白念珠菌不同培养时间的上清,确定检测方法的灵敏度;检测其他3种念珠菌、5种曲霉、新型隐球菌和马尔尼菲青霉的培养上清,评价检测方法的特异性。结果成功构建表达载体并获得真核表达重组蛋白rCsa2,经SDS-PAGE鉴定相对分子质量(Mr)为13 300,符合预期值;Western blot法证实该蛋白可与特异性抗体结合。免疫动物获得高效价免疫血清,并以此成功建立双抗体夹心ELISA,可检测rCsa2蛋白的灵敏度约为240 pg/mL,并最早可检测到培养18 h的白念珠菌培养上清,与其他10种临床常见真菌的培养上清无交叉反应。结论建立了有较高的检测灵敏度和特异性的Csa2的双抗体夹心ELISA,为区别诊断白念珠菌感染提供新的方法。

合成肽VAR2特异性结合循环肿瘤细胞的检测及临床应用

目的探讨疟疾蛋白(VAR2)合成肽特异性结合循环肿瘤细胞(CTCs)的检测及临床应用。方法选择疟疾蛋白VAR2CSA功能结构域肽段序列合成VAR2多肽;基于纳米微流控技术富集CTCs,利用VAR2合成肽对富集细胞进行检测,建立一种新型CTCs检测方案。用细胞免疫荧光染色、流式细胞测量术及肿瘤细胞掺入回收实验,分析VAR2合成肽与不同组织来源肿瘤细胞特异性结合、回收效率,并与免疫荧光原位杂交(imFISH)检测法进行比较。选取22例结直肠癌患者与22名健康者,利用VAR2合成肽检测两者外周血CTCs。比较不同TNM分期患者CTCs阳性检出率。结果合成肽VAR2可以与人结肠癌细胞系SW620、人乳腺癌细胞系MCF7和人食管鳞癌细胞系KYSE180不同组织来源的肿瘤细胞特异性结合,合成肽VAR2检测100个SW620、MCF7、KYSE180肿瘤细胞掺入3 mL外周血中的回收率分别为82.8%±8.41%、56.2%±3.57%、86.6%±8.19%,与imFISH法检测法比较,差异无统计学意义。合成肽VAR2检测50、100、200个3种不同肿瘤细胞的回收率与掺入肿瘤细胞的数量没有明显相关性。合成肽VAR2检测临床结直肠癌患者外周血样本CTCs阳性率为63.6%,高于健康受试者组CTCs阳性率的0.0%,同时与侵袭深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期相关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论合成肽VAR2可实现对不同组织来源、非抗体依赖性的特异性CTCs检测,对于肿瘤患者临床分期、病情评估具有一定的临床应用价值。