枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)cspB基因转化烟草(Nicotiana tabacuum)的研究

细菌冷休克蛋白cspB是原核生物RNA的分子伴侣,含有原始型的冷休克结构域,具有与核酸结合功能,可以防止RNase对mRNA的降解,也能纠正mRNA的折叠错误。为了寻找作物改良的潜在基因资源,从枯草芽孢杆菌XS-01基因组中克隆出cspB基因,并与pBI121构建成pBI121-cspB植物表达载体。利用叶圆盘转化法转化烟草,通过卡那霉素筛选和PCR、Southern杂交鉴定5个转化体株系。除TN010外,其他转基因株系在外观形态与野生亲本的没有差别,但TN001和TN011育性降低,TN010和TN012则完全丧失育性。干旱处理结果表明,转基因植株在土壤水分恢复后10 d,其平均单株干物质质量较之野生亲本的显著增加;叶片光合速率测定结果表明,在干旱处理时,转基因植株和对照亲本叶片光合速率均显著下降,在土壤水分恢复后,转基因植株的光合速率能快速恢复,但对照亲本的恢复缓慢。实验结果说明,cspB能够促进植物细胞从逆境伤害中快速恢复功能。

CspB基因植物表达载体的构建及转化玉米自交系的研究

利用来自Bacillus subtilis细菌的CspB基因(Gene ID:936224)构建了Ubiquitin启动子驱动的CspB基因植物表达载体PBPC-CspB-bar,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的表达载体转化到玉米自交系京501、京517和吉444,通过喷洒除草剂筛选得到60株草丁膦抗性植株,用PCR检测得到48株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行CspB基因PCR鉴定,获得13株同时整合CspB和bar的转基因株系。

转cspB基因玉米获得及其耐盐碱性分析

本研究依据Gen Bank数据库中发表的枯草芽孢杆菌cspB基因序列进行优化,人工合成了cspB基因序列,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法将cspB基因转入玉米自交系Hi-Ⅱ中,获得转cspB基因玉米材料,经过分子检测获得4个阳性转化事件。在4个浓度水平的NaCl溶液(0,40 mmol/L,80 mmol/L,120 mmol/L)和Na_2CO_3溶液(0,10 mmol/L,20 mmol/L,30 mmol/L)胁迫下,研究其耐盐碱性。结果表明:80 mmol/L的NaCl溶液和20 mmol/L Na_2CO_3溶液可以作为转cspB基因玉米的耐盐碱分析条件;cspB基因已经整合到玉米基因组中,转cspB基因玉米的耐盐碱性得到了显著提高。转cspB基因玉米丰富了耐盐碱玉米种质资源。

cspB异源表达对提高转基因烟草植株耐高温能力的影响

为了解枯草芽孢杆菌cspB基因在植物中异源表达对植物应对逆境的影响,将cspB基因插入到pBI121的35S启动子下游取代原有的gus A基因,该基因的植物表达载体被命名为p BI121-csp B,通过农杆菌介导的转化法转化烟草,通过筛选培养获得转基因植株。RT-PCR分析表明,转基因烟草株系中均有csp B基因表达,其中TN012株系中表达量较大。转基因植株TN012和非转基因对照植株经38℃高温处理一周,再在25℃条件下恢复生长,经过7d的恢复生长,TN012的生物量明显高于对照植株。高温处理前,TN012与对照植株光合速率无明显差异,高温处理后TN012的光合速率显著高于对照植株的。TN012细胞中的可溶性蛋白在高温处理后明显上升,而对照植株的则明显下降。结果表明csp B基因植物异源表达提高植物对高温的抗性,cspB基因可以作为用于耐高温作物育种的基因资源。

耐旱基因cspB转化大豆的研究

为提高大豆的耐旱性,本研究根据大豆偏爱的密码子将来源于枯草杆菌抗旱相关基因cspB序列进行了优化,并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-cspB,利用农杆菌介导法将cspB基因导入大豆栽培品种Bert中。用于遗传转化子叶节外植体共3 800个,经PCR和Southern鉴定,并结合PPT抗性筛选,共获得了95棵阳性转基因植株,转化率为2.5%。经初步筛选,获得了7份耐旱性较好的转基因大豆新材料。这些材料将进一步用于耐旱转基因大豆新品种培育工作。