草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NCCRP-1基因的克隆和原核表达

应用RACE PCR克隆了草鱼NCCRP-1基因。结果表明,NCCRP-1cDNA全长900 bp,开放阅读框为714 bp,编码237个氨基酸残基,预测分子量为27.3 kD,理论等电点为5.63。草鱼NCCRP-1具有NCCRP-1蛋白家族保守的功能区域,与鲤鱼该基因(Cyprinus carpioL.)的相似性为88%。将此基因定向插入原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-NCCRP后转化BL2(1DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE分析显示在47.8 kD处出现特异性蛋白条带,Western blot检测表明草鱼NCCRP-1融合蛋白成功表达。

草鱼原癌基因c-fos的原核表达载体构建及蛋白表达纯化

为克隆草鱼原癌基因c-fos,构建原核表达载体,诱导表达并纯化c-Fos融合蛋白,为c-Fos蛋白的多克隆抗体制备奠定前期基础。在生物信息学技术方法指导下,利用引物设计软件Primer Premier 5设计c-fos基因的特异性引物,扩增得到883 bp长度的目标核酸片段,构建了原核表达载体pET-28a/c-fos,转化至E.coli Rosetta原核表达系统中通过IPTG诱导表达,检测到连接有His标签的c-Fos蛋白,最终通过His镍柱纯化得到了His-c-Fos融合蛋白。该融合蛋白可作为抗原用于后期c-Fos蛋白的多克隆抗体制备,为其组织和亚细胞定位及生物学功能研究奠定基础。