Cu-Zn SOD活力变化与铝致小鼠神经元退行性变关系

目的观察在铝染毒致小鼠脑神经元退行性变过程中铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)活力变化的规律,以分析两者的关系。方法葡萄糖酸铝溶液(按Al3+400 mg/kg剂量)灌胃给予小鼠,1次/d,每周5 d,连续12周。观察小鼠被动回避性学习记忆能力和空间识别能力的改变、脑组织Cu-Zn SOD活力、脑组织丙二醛(MDA)和总蛋白含量的变化,以及海马神经元的病理形态学变化。结果与对照组比较,铝染毒小鼠第6周后跳台潜伏期呈时间依赖性进行性缩短,而水迷宫寻台时间显著延长,大脑皮层和海马Cu-Zn SOD活力呈明显先升高后下降趋势,MDA和蛋白水平持续升高,海马出现进行性神经元核固缩加重和神经元丢失。结论铝染毒导致代表小鼠脑氧化应激的MDA含量增加和代表抗氧化应激反应的Cu-Zn SOD活力增强;两者反应失衡可能与铝染毒致神经元退行性变有关。

人参Cu/Zn SOD原核可溶性表达条件的优化

目的在大肠杆菌中高效表达可溶性人参SOD,纯化后检测其活性。方法人参SOD cDNA插入到原核表达载体pET30α中,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达。分别对诱导时间、诱导温度、IPTG浓度以及离子浓度进行条件优化。对表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测。检测上清中蛋白的抗氧化活性。结果双酶切结果显示质粒构建成功,经过条件优化,表达的SOD蛋白主要存在于破碎菌体的上清中,表达量约占菌体上清总蛋白的50%,上清酶活达到363.9 U/mg。结论成功在大肠杆菌中高效表达了可溶性人参SOD蛋白,且具有较高的酶活性,为其工业化生产和应用奠定了基础。

健康成人外周血细胞Cu/Zn SOD的放免分析

本文报道健康成人外周血细胞成分中Cu/Zn SOD的放免分析结果,红细胞Cu/Zn SOD定量为37.88±9.60ng/10~6。淋巴细胞和多形核白细胞Cu/Zn SOD,浓度分别为335.00±120.50/及189.43±139.67/10~6细胞。淋巴细胞Cu/Zn SOD量>多形核白细胞,此结果同其他作者研究正常人外周血淋巴细胞SOD-1活性>多形核白细胞相符合,表明血细胞中SOD-1活性与其克分子数相关。本文还就红细胞,淋巴细胞及多形核白细胞SOD-1的生物学特性及其在某些疾病过程中的异常变化,作了简要论述。

脑梗塞患者外周红细胞Cu/Zn SOD水平变化的观察

本文报告18例脑梗塞患者及50例正常人外周RBC胞液及其胞膜SOD—1(Cu/Zn—SOD)放免测定值,结果表明94.44％的脑梗塞患者红细胞液SOD—1呈极显著性降低(P<0.001),提示脑梗塞病理过程中红细胞内氧自由基(O_2^-)产生异常。胞外O_2^-可通过RBC膜阴离子通道进入胞内增多,引起胞内SOD—1歧化作用而耗损增加,导致RBC胞液SOD—1降低。本文还观察10例脑梗塞患者RBC膜SOD—1含量未见明显变化,并就RBC内O_2^-产生异常的机理作简要论述。

东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的克隆及序列分析

[目的]对东亚砂藓(Rhacomitrunm japonicum)的Cu/Zn SOD基因进行克隆,并对其序列进行分析。[方法]利用RT-PCR技术获得东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的cDNA,同时对该序列进行生物信息学分析。[结果]东亚砂藓Cu/Zn SOD基因cDNA长565 bp,包含一个长为465 bp的ORF,编码154个氨基酸残基,预测的该蛋白的分子量为15.5 kD,理论等电点为5.77,负电荷残基(Asp+Glu)总数为18个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为12个,不稳定系数是13.36;其编码的氨基酸序列包含了5个蛋白保守区,均为铜锌超氧化物歧化酶超家族所有;Blastn比对表明东亚砂藓Cu/Zn SOD基因与毛尖紫萼藓、小立碗藓相关基因的同源性高达99%和82%。[结论]该研究为进一步研究紫萼藓科植物的抗旱性及苔藓Cu/Zn-SOD在抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据与基础。

少弱精子症患者精子候选差异蛋白Cu-Zn SOD和GSS的验证及其表达研究

目的根据串联质谱标签(TMT)技术筛选少弱精子症患者精子差异蛋白,选取Cu-Zn SOD和GSS蛋白进行验证,建立候选蛋白标志物,并探讨二者的表达及意义。方法选择2017年7月-2018年4月在新疆医科大学第一附属医院生殖医学中心就诊的男性,收集105例少精子症(O组)、150例弱精子症(A组)、50例少弱精子症(OA组)和106例正常(N组)者的精液,分离精子,对少弱精子症患者精子进行差异蛋白质组学筛查,并在生物信息学分析基础上,选取Cu-Zn SOD和GSS蛋白,用免疫荧光和免疫印迹方法检测其在O组、A组、OA组和N组的表达量。结果少弱精子症患者精子,Cu-Zn SOD为下调差异蛋白(为N组的0.77倍),GSS为下调差异蛋白(为N组的0.82倍)。免疫荧光和免疫印迹结果显示,O组、A组和OA组精子Cu-Zn SOD蛋白的表达明显低于N组,差异有统计学意义(P<0.05)。OA组精子GSS蛋白表达明显低于N组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Cu-Zn SOD和GSS蛋白与OA组蛋白质组学筛选结果一致,可作为少弱精子症男性精子的候选标志物。Cu-Zn SOD和GSS含量降低可能在少弱精子症患者精子氧化应激损伤过程中发挥重要作用,同时Cu-Zn SOD含量降低与少精、弱精子症患者精子质量改变相关。

抗人Cu/Zn SOD单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人Cu/Zn SOD单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以人Cu/Zn SOD作为免疫原免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗人Cu/Zn SOD单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA、斑点ELISA、Western Blot、免疫组化鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、亚型及相对亲和力。结果筛选到一株可稳定分泌抗人Cu/Zn SOD单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H10H4B12,亚型鉴定重链为IgG2a,轻链为kappa链。ELISA法测定腹水效价为1∶256,000,抗体相对亲和力为1.101×109mol/L。斑点ELISA、Western Blot显示抗体能特异识别免疫原、人肝细胞株HL-7702和人红细胞中的天然Cu/Zn SOD;不与鼠Cu/Zn SOD和人Mn SOD发生交叉反应。免疫组化进一步显示了人Cu/Zn SOD均匀分布于细胞的胞浆中。结论成功制备了抗人Cu/Zn SOD单克隆抗体,为进一步研究其与腹主动脉瘤的关系奠定了基础。

Cu,Zn SOD in Shandong families with amyotrophic lateral sclerosis

Objective: To understand the relationship between Cu,Zn SOD and amyotrophic lateral sclerosis. Methods: The patients were clinically examined and classified according to the E1 Escorial Criteria, then we obtained blood samples from the patients for Cu,Zn SOD analysis and SOD assay. Amino acid analysis of Cu,Zn SOD were fully automated in instruments called amino acid analyzers. SOD assay was determined by cytochrome c method Results: Amino acid analysis of Cu,Zn SOD from patients with familial ALS was normal. The activity of Cu,Zn SOD was normal both in familial and sporadic form of ALS compared with normal person. Conclusion: Amyotrophic lateral sclerosis is not related to Cu,Zn SOD.

hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白的制备、穿膜效应及其抗氧化、抗炎症功效

目的 探究人源性细胞膜穿透肽hPP10携带人源性抗氧化蛋白Cu,Zn-SOD的穿膜效应并观察其抗氧化、抗炎功效。方法利用RT-PCR技术扩增人源性SOD基因片段、酶切连接法构建重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD;利用镍柱亲和层析法、分子筛方法纯化Cu,Zn-SOD、hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白并利用Western blotting法鉴定其正确性;利用免疫荧光法、荧光共定位实验、Western blotting法鉴定hPP10-Cu,Zn-SOD在细胞中的穿膜效应;利用Western blotting法鉴定hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白穿膜时间梯度和浓度梯度效应;利用SOD酶活性测定试剂盒检测hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后的SOD酶活性;利用MTT法检测hPP10对细胞活性的影响。利用H2O2建立HEK293氧化应激细胞模型,通过流式细胞分析术(FCM)分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后细胞凋亡情况;并RT-qPCR分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后凋亡相关因子的表达情况;通过ROS检测分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后抗氧化能力。TPA诱导建立小鼠耳部炎症模型(5只/组,共4组),然后RT-qPCR分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后,NFκB,IL-1β、IL-6、TNFα因子的转录情况;Western blotting检测NFκB p65、p-NFκB p65、IL-1β、TNFα基因的表达;免疫组化分析炎性因子p-NFκB p65、TNFα基因的表达。结果 成功构建了重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD,并获得Cu,Zn-SOD蛋白和hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白;免疫荧光试验结果表明5μmol/L浓度的hPP10-Cu,Zn-SOD转导HEK293细胞具有明显的穿膜效应;荧光共定位实验显示融合蛋白hPP10-Cu,Zn-SOD入胞后定位在细胞膜内,部分蛋白定位在细胞核内;Western blotting实验结果表明hPP10-Cu,Zn-SOD转导Hela(P<0.05),HEK293(P<0.01)细胞具有浓度依赖性,细胞内hPP10-Cu,Zn-SOD存在可持续24 h;5μmol/L的hPP10-Cu,Zn-SOD转导细胞具有较好的抗氧化活性(P<0.01);MTT结果显示高达10μmol/L浓度的hPP10-Cu,Zn-SOD对于细胞活力的影响小。在氧化应激模型中,FCM结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞降低了细胞的早期凋亡(P<0.01)和晚期凋亡(P<0.05);RT-qPCR结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞使Bcl2、Mcl1、Deptor等抗凋亡因子升高(P<0.05),降低了Bad、P21、P27等促凋亡因子的表达(P<0.05);ROS结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞显著降低了细胞内的活性氧含量(P<0.01)。在炎症模型中,hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白可显著降低IL-1β、IL-6、TNFα因子的转录(P<0.05);p-NFκB p65、IL-1β及TNFα的表达都呈现了抑制作用(P<0.05);hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白处理组较Cu,Zn-SOD蛋白处理组,降低了炎性因子p-NFκB p65及TNFα基因的表达(P<0.05)。结论 融合蛋白hPP10-Cu,Zn-SOD具有明显的穿膜入胞、抗氧化、抗炎功效,且对细胞毒副作用很小。这些结果为hPP10作为新的递送载体奠定基础,也为hPP10-Cu,Zn-SOD应用于护肤品等提供了理论依据。

妇科肿瘤血清Cu、Zn及CuZn-SOD活力的检测

目的：本研究探讨妇科肿瘤患者血清Cu、Zn及CuZn-SOD活力的变化及其意义。方法：采用原子吸收分光光度法和黄嘌呤氧化酶法测定患者与正常对照组血清Cu、Zn及CuZn-SOD的活力。结果：妇科良、恶性肿瘤血清Cu含量均高于正常对照组，妇科恶性肿瘤血清Cu高于妇科良性肿瘤。妇科良恶性肿瘤Zn、CuZn-SOD活力均低于正常组，妇科恶性肿瘤血清Zn、CuZn-SOD活力低于妇科良性肿瘤。结论：妇科肿瘤的发生发展与微量元素、自由基紊乱有关。

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus)Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明,Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。

丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析

【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族,并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用,为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据,为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族的c DNA序列,采用生物信息学方法分析氨基酸序列,利用荧光定量PCR技术研究Cu/Zn-SOD基因家族在不同组织及褐变条件下的表达情况。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定总超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用福林-酚比色测定总酚含量。【结果】获得了3个丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族c DNA序列,依次命名为Lc Cu/Zn-SOD1(Gen Bank登录号:KP178922)、Lc Cu/Zn-SOD2(Gen Bank登录号:KX092445)和Lc Cu/Zn-SOD3(Gen Bank登录号:KX092446)。Lc Cu/Zn-SOD1全长758 bp,包含一个456 bp的开放读码框(ORF),编码152个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD2全长799 bp,ORF为471 bp,编码157个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD3全长1 011 bp,ORF为663 bp,编码221个氨基酸;编码的蛋白与甜瓜、南瓜、黄瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息学分析表明3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质。Cu/Zn-SOD基因家族在根中的表达量最高,在花中表达量最低。在丝瓜采后储藏期间,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在丝瓜储藏初期表达量较采后当时(0 d)上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,3个基因表达量在鲜切后较采后当时(0 h)总体呈下降趋势。相关性分析显示,在采后储藏和鲜切条件下,Lc Cu/Zn-SOD1表达量均与SOD酶活性呈极显著性正相关,Lc Cu/Zn-SOD3表达量均与SOD酶活性呈显著性正相关,SOD酶活性在鲜切条件下与总酚含量呈显著负相关,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在调控SOD酶活性方面起作重要作用,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3的表达影响了SOD酶活性,并影响了丝瓜褐变进程。【结论】从丝瓜果肉中获得Cu/Zn-SOD基因家族的3个,其中Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。

LaCl_3对大豆Cu,Zn-SOD活性影响研究

研究证明0～100μmol·L-1的LaCl3对于大豆Cu,Zn SOD的NBT光还原活性抑制作用具有明显影响,即受La3+作用,大豆Cu,Zn SOD活性动力学曲线为S形,同时受La3+作用Cu,Zn SOD的热稳定性明显提高。大豆Cu,Zn SOD受La3+作用的阈值浓度和饱和浓度分别为cLa3+=18μmol·L-1,cLa3+=65μmol·L-1。根据Hill系数3.9和荧光光谱分析,大豆Cu,Zn SOD分子中存在4个La3+的强结合位点。证明了La3+对Cu,Zn SOD具有明显的正协同效应。

Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草。进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达。对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性。

杨梅Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(MrSOD1)cDNA的克隆及表达分析

以杨梅叶为材料,利用RT-PCR技术克隆Cu/Zn超氧化物歧化酶基因,并利用半定量RT-PCR方法分析该基因在不同组织中的表达。获得1个杨梅Cu/ZnSOD基因编码区全长cDNA序列,长度为461bp,编码一个由152个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质具有Cu/ZnSOD的特征信号序列;序列同源性分析表明,其与GenBank中注册的Cu/ZnSOD序列的同源性均在77%以上。该基因命名为MrSOD1(GenBank登录号:GQ404510)。半定量RT-PCR分析显示,MrSOD1在4种组织中表达量为:果>叶>花>枝条。本试验为进一步研究MrSOD1的时空表达特性、调控途径及杨梅抗氧化伤害的分子机理奠定基础。

丹参铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆与生物信息学分析

依据已构建的丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)cDNA文库和降落PCR的方法获得丹参胞质铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、亲水性/疏水性、二级结构以及功能等方面进行了预测和分析.结果表明,克隆得到的丹参Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD在序列组成、结构及活性位点等方面均有高度的相似性.

荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证

以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、胚乳特异表达元件,且可能受WRKY和MYB等转录因子调控。通过双酶切方法,以ProLcCSD3替换载体pCAMBIA1301上的CaMv35S启动子,构建了重组质粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功转化农杆菌EHA105和GV3101。注射烟草的瞬时表达分析表明,该启动子片段可以驱动下游报告基因表达。转化拟南芥分析表明,该启动子驱动的下游GUS可以在拟南芥的根、茎、叶中表达,且可响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤等非生物胁迫。研究表明,荔枝古树LcCu/Zn-SOD3可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径。

哈密瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及生物信息学分析

依据NCBI中已克隆的葫芦科植物黄瓜和西瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,以哈密瓜果肉总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,最终获得一段403bp的哈密瓜Cu/Zn-SOD(HmCu/Zn-SOD)基因片段,运用Blast比对,系统进化树分析最终确定所克隆的基因片段为哈密瓜的Cu/Zn-SOD基因序列。运用蛋白质分析软件分析结果表明,克隆得到的哈密瓜Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和β-折叠等蛋白质二级结构元件构成,同时与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD的组成成分和理化性质具有高度的相似性。

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础。

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。