白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus)Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明,Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。

杨梅Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(MrSOD1)cDNA的克隆及表达分析

以杨梅叶为材料,利用RT-PCR技术克隆Cu/Zn超氧化物歧化酶基因,并利用半定量RT-PCR方法分析该基因在不同组织中的表达。获得1个杨梅Cu/ZnSOD基因编码区全长cDNA序列,长度为461bp,编码一个由152个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质具有Cu/ZnSOD的特征信号序列;序列同源性分析表明,其与GenBank中注册的Cu/ZnSOD序列的同源性均在77%以上。该基因命名为MrSOD1(GenBank登录号:GQ404510)。半定量RT-PCR分析显示,MrSOD1在4种组织中表达量为:果>叶>花>枝条。本试验为进一步研究MrSOD1的时空表达特性、调控途径及杨梅抗氧化伤害的分子机理奠定基础。

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础。

丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析

【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族,并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用,为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据,为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族的c DNA序列,采用生物信息学方法分析氨基酸序列,利用荧光定量PCR技术研究Cu/Zn-SOD基因家族在不同组织及褐变条件下的表达情况。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定总超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用福林-酚比色测定总酚含量。【结果】获得了3个丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族c DNA序列,依次命名为Lc Cu/Zn-SOD1(Gen Bank登录号:KP178922)、Lc Cu/Zn-SOD2(Gen Bank登录号:KX092445)和Lc Cu/Zn-SOD3(Gen Bank登录号:KX092446)。Lc Cu/Zn-SOD1全长758 bp,包含一个456 bp的开放读码框(ORF),编码152个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD2全长799 bp,ORF为471 bp,编码157个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD3全长1 011 bp,ORF为663 bp,编码221个氨基酸;编码的蛋白与甜瓜、南瓜、黄瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息学分析表明3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质。Cu/Zn-SOD基因家族在根中的表达量最高,在花中表达量最低。在丝瓜采后储藏期间,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在丝瓜储藏初期表达量较采后当时(0 d)上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,3个基因表达量在鲜切后较采后当时(0 h)总体呈下降趋势。相关性分析显示,在采后储藏和鲜切条件下,Lc Cu/Zn-SOD1表达量均与SOD酶活性呈极显著性正相关,Lc Cu/Zn-SOD3表达量均与SOD酶活性呈显著性正相关,SOD酶活性在鲜切条件下与总酚含量呈显著负相关,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在调控SOD酶活性方面起作重要作用,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3的表达影响了SOD酶活性,并影响了丝瓜褐变进程。【结论】从丝瓜果肉中获得Cu/Zn-SOD基因家族的3个,其中Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。

碱茅(Puccinellia tenuifolra)Put-Cu／Zn-SOD基因的克隆及在酵母中的表达

从碱茅根cDNA文库分离得到Put-Cu/Zn-SOD全长cDNA,其序列全长为2700bp,该基因的开放读码框为长615bp,所编码的蛋白由204个氨基酸组成,其预测分子量约为20.6kD、理论等电点约为5.63。Put-Cu/Zn-SOD氨基酸序列与水稻Cu/Zn-SOD序列有较高的同源性为87%。将Put-Cu/Zn-SOD基因构建到酵母表达载体pYES2,并转化至酵母(INVSc1)。对pYES2-Put-Cu/Zn-SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验。结果表明:重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照(pYES2转化酵母),结果显示了碱茅的Cu/Zn-SOD基因在酵母表达中,具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力。

Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草。进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达。对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性。

哈密瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及生物信息学分析

依据NCBI中已克隆的葫芦科植物黄瓜和西瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,以哈密瓜果肉总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,最终获得一段403bp的哈密瓜Cu/Zn-SOD(HmCu/Zn-SOD)基因片段,运用Blast比对,系统进化树分析最终确定所克隆的基因片段为哈密瓜的Cu/Zn-SOD基因序列。运用蛋白质分析软件分析结果表明,克隆得到的哈密瓜Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和β-折叠等蛋白质二级结构元件构成,同时与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD的组成成分和理化性质具有高度的相似性。

丹参铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆与生物信息学分析

依据已构建的丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)cDNA文库和降落PCR的方法获得丹参胞质铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、亲水性/疏水性、二级结构以及功能等方面进行了预测和分析.结果表明,克隆得到的丹参Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD在序列组成、结构及活性位点等方面均有高度的相似性.

转人Cu,Zn-SOD基因马铃薯的研究

采用 RT-PCR技术从人肝总 RNA中分离扩增了 490 bp的人铜锌超氧化物歧化酶(h Cu,Zn-SOD)基因的 c DNA序列 ,进行了序列测定 ,结果和文献报道的一致 ;构建了 Ca Mv3 5 S启动子驱动 h Cu,Zn-SOD基因的植物表达载体 PBICu SOD;用三亲交配法将重组质粒 PBICu SOD转化到农杆菌 LBA440 4,转化马铃薯得到转基因植株。PCR和 Southern-blot分析证明 ,h Cu,Zn-SOD基因已整合到马铃薯基因组中。Western blot分析表明 ,h Cu,Zn-SOD基因在转基因马铃薯植株中得到表达。用 NBT光还原法测定转基因马铃薯植株中的 SOD酶活力 ,叶的总酶活为1 0 66.6U/ g(湿重 ,下同 ) ,块茎的总酶活为 1 0 1 1 U/ g。

荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证

以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、胚乳特异表达元件,且可能受WRKY和MYB等转录因子调控。通过双酶切方法,以ProLcCSD3替换载体pCAMBIA1301上的CaMv35S启动子,构建了重组质粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功转化农杆菌EHA105和GV3101。注射烟草的瞬时表达分析表明,该启动子片段可以驱动下游报告基因表达。转化拟南芥分析表明,该启动子驱动的下游GUS可以在拟南芥的根、茎、叶中表达,且可响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤等非生物胁迫。研究表明,荔枝古树LcCu/Zn-SOD3可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径。

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明:双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5'端非编码区,261 bp 3'端非翻译区和453 bp开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2+和Zn2+结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15 249 900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。

西红柿CU／ZnSOD基因在大肠杆菌中高效表达的研究

利用带有Ｔｒｐ启动子的大肠杆菌表达载体ＷＣＣ８能有效地表达西红柿Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因，该表达蛋白在菌体中具有活性，并在一定程度上抑制受体菌ＳＯＤ基因的表达。据ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，表达ＳＯＤ蛋白占茵体总蛋白２０％左右，其活性达３．０×１０５Ｖ／Ｌ发酵液。还利用ＮＢＴ法对表达ＳＯＤ蛋白的活性进行了研究。

miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。

半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达及酶活性研究

【目的】首次对半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达、酶活性进行研究,以期了解半番鸭不同组织抗氧化特性,为深入研究半番鸭对环境因子的响应能力及相关分子机制提供参考。【方法】通过实时荧光定量法、黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分别测定了半番鸭心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌胃和胸肌中的Cu/Zn-SOD mRNA相对表达量、酶活力和MDA含量。【结果】Cu/Zn-SOD mRNA在胸肌中相对表达量最高,总体趋势为胸肌>肝脏>肺>心脏>脾脏>肾脏/肌胃。酶活力测定结果显示,肝脏和肾脏Cu/Zn-SOD酶活力显著高于胸肌和肌胃。半番鸭胸肌MDA含量显著高于肝脏、肌胃和肾脏,提示胸肌可能更易受到氧化应激损伤。相关分析结果显示Cu/Zn-SOD活力与MDA含量呈显著负相关,而抗氧化酶活力与mRNA表达水平相关性不显著。【结论】半番鸭Cu/Zn-SOD基因表达和酶活力具有组织特异性。不同组织Cu/Zn-SOD活力差异可能与Cu/Zn-SOD自身的生理功能以及组织代谢水平有关。

重金属对褶纹冠蚌Cu/ZnSOD基因mRNA表达和酶活性的影响

为研究重金属离子对褶纹冠Cu/ZnSOD基因mRNA表达和酶活性的影响,采用Cd2+,Cu2+和Pb2+单一胁迫褶纹冠蚌72h,检测0,6,12,24,48和72h,Cu/ZnSODmRNA表达和酶活性的变化。结果表明:在Cd2+胁迫下,Cu/ZnSODmRNA表达量及酶活性均随暴露时间延长而逐渐升高,72h达到峰值,且48和72h均显著性高于对照组(P<0.05);在Cu2+胁迫下,Cu/ZnSOD mRNA表达量及酶活性具有先升高后降低的趋势,12h两者达到峰值,其中,Cu/ZnSOD mRNA表达量在12h显著高于对照组(P<0.05),Cu/ZnSOD酶活性在6,24,48和72h的表达量均显著高于对照组(P<0.05);Pb2+胁迫与Cu2+胁迫趋势相似,Cu/ZnSODmRNA表达量及酶活性均在48h达到峰值,Cu/ZnSODmRNA表达量在24,48和72h显著性高于对照组(P<0.05),Cu/ZnSOD酶活性在48和72h的表达量均显著高于对照组(P<0.05)。说明褶纹冠蚌内脏团中Cu/ZnSODmRNA和酶可以作为生物标志物对水环境中的重金属污染进行检测。

杨梅铜锌超氧化物歧化酶基因(MrCu/Zn-SOD1)的原核表达及活性鉴定

为获得高表达杨梅(Morella rubra)铜锌超氧化物歧化酶(MrCu/Zn-SOD1)的工程菌,本实验采用RT-PCR技术从杨梅果实中分离扩增了MrCu/Zn-SOD1的cDNA序列(456bp),将该基因重组到原核表达载体pGEX-2T中,酶切、测序分析表明,重组质粒pGEX-MrCu/Zn-SOD1结构正确。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。IPTG诱导表达分子量约41kD融合蛋白GST-MrCu/Zn-SOD1。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽亲和层析纯化,得到高纯度的GST-MrCu/Zn-SOD1。采用氯化硝基四氮唑蓝法和黄嘌呤氧化法分析其活性。结果表明,GST-MrCu/Zn-SOD1具有特异性SOD酶活性。

吴茱萸Cu/Zn-SOD基因全长cDNA克隆与序列分析

目的:克隆获得与吴茱萸抗逆性密切相关的Cu/Zn-SOD基因cDNA全长序列。方法:采用RACE技术获得了该基因的开放阅读框(ORF)和3,5,端非编码区。结果:该基因全长717 bp,ORF区为459 bp,编码152个氨基酸,GenBank登录号为JQ285851。结论:该基因为吴茱萸Cu/Zn-SOD基因cDNA全长序列,与其它植物的Cu/Zn-SOD基因具有较高的同源性。

东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的克隆及序列分析

[目的]对东亚砂藓(Rhacomitrunm japonicum)的Cu/Zn SOD基因进行克隆,并对其序列进行分析。[方法]利用RT-PCR技术获得东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的cDNA,同时对该序列进行生物信息学分析。[结果]东亚砂藓Cu/Zn SOD基因cDNA长565 bp,包含一个长为465 bp的ORF,编码154个氨基酸残基,预测的该蛋白的分子量为15.5 kD,理论等电点为5.77,负电荷残基(Asp+Glu)总数为18个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为12个,不稳定系数是13.36;其编码的氨基酸序列包含了5个蛋白保守区,均为铜锌超氧化物歧化酶超家族所有;Blastn比对表明东亚砂藓Cu/Zn SOD基因与毛尖紫萼藓、小立碗藓相关基因的同源性高达99%和82%。[结论]该研究为进一步研究紫萼藓科植物的抗旱性及苔藓Cu/Zn-SOD在抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据与基础。

芝麻Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的全基因组鉴定与分析

铜/锌超氧化物岐化酶(Cu/Zn-SOD)是植物体内非常重要的一种活性氧清除酶系统,本研究通过blast的方法,在芝麻全因组水平进行Cu/Zn-SOD的鉴定。结果显示,芝麻中含有4条Cu/Zn-SOD,分别命名为SiCSD1、SiCSD2、SiCSD3、SiCSD4。理化性质分析表明,4种蛋白质均为酸性蛋白质,除SiCSD3外,均为亲水蛋白。结构域分析发现,蛋白质均含有Cu/Zn-SOD特有的结构域和金属离子结合域,但都不具有跨膜结构和信号肽。亚细胞定位预测分析发现,SiCSD1-3均定位于叶绿体,SiCSD4除了叶绿体,也有可能定位于细胞质。进化树分析发现,SiCSD3与拟南芥AtCSD2聚为一支,SiCSD4与拟南芥AtCSD3聚为一支,SiCSD1和SiCSD2与烟草NpSODC、番茄SlSODC1和SlSODC2聚在一个大的分支。以上结果初步表明,SiCSD1-4具有Cu/Zn-SOD共同的理化性质,其序列的鉴定将为后续功能的研究打下基础。