杉木Cu/Zn-SOD基因克隆、序列特征及组织特异性表达

超氧化物歧化酶是植物体中的重要金属酶,Cu/Zn-SOD在超氧化物歧化酶中比例最大,它能够清除细胞内的超氧阴离子,保护机体免受氧化损伤。Cu/Zn-SOD基因对植物的抗氧化性有重要的作用,目前已证实在烟草、玉米等作物在逆境下抗氧化能力有所提高,但在杉木中的Cu/ZnSOD基因功能尚未深入研究。本研究以杉木组培苗为材料,通过RT-PCR技术,获得一段461bp的杉木Cu/Zn-SOD基因片段,运用生物信息学技术预测该基因蛋白的理化性质、亲疏水性、氨基酸组成、二三级结构、磷酸化结构及蛋白功能。结果表明,杉木Cu/Zn-SOD基因的ORF长度为312bp,编码104个氨基酸,预测蛋白理论等电点为5.61,分子量为15.287 91kD,是亲水性蛋白;同源氨基酸序列比对结果表明杉木Cu/Zn-SOD基因亚细胞定位预测该基因定位于细胞质内,Cu/Zn-SOD蛋白二三级结构无规则卷曲占取比例最大;预测未发现跨膜结构,在第18号氨基酸时为信号肽剪切位点,该蛋白属非分泌蛋白。杉木Cu/Zn-SOD基因的克隆对研究裸子植物及其分子机制具有重要意义,同时为植物Cu/Zn-SOD基因家族提供依据。

Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草。进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达。对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性。

丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析

【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族,并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用,为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据,为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族的c DNA序列,采用生物信息学方法分析氨基酸序列,利用荧光定量PCR技术研究Cu/Zn-SOD基因家族在不同组织及褐变条件下的表达情况。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定总超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用福林-酚比色测定总酚含量。【结果】获得了3个丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族c DNA序列,依次命名为Lc Cu/Zn-SOD1(Gen Bank登录号:KP178922)、Lc Cu/Zn-SOD2(Gen Bank登录号:KX092445)和Lc Cu/Zn-SOD3(Gen Bank登录号:KX092446)。Lc Cu/Zn-SOD1全长758 bp,包含一个456 bp的开放读码框(ORF),编码152个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD2全长799 bp,ORF为471 bp,编码157个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD3全长1 011 bp,ORF为663 bp,编码221个氨基酸;编码的蛋白与甜瓜、南瓜、黄瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息学分析表明3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质。Cu/Zn-SOD基因家族在根中的表达量最高,在花中表达量最低。在丝瓜采后储藏期间,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在丝瓜储藏初期表达量较采后当时(0 d)上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,3个基因表达量在鲜切后较采后当时(0 h)总体呈下降趋势。相关性分析显示,在采后储藏和鲜切条件下,Lc Cu/Zn-SOD1表达量均与SOD酶活性呈极显著性正相关,Lc Cu/Zn-SOD3表达量均与SOD酶活性呈显著性正相关,SOD酶活性在鲜切条件下与总酚含量呈显著负相关,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在调控SOD酶活性方面起作重要作用,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3的表达影响了SOD酶活性,并影响了丝瓜褐变进程。【结论】从丝瓜果肉中获得Cu/Zn-SOD基因家族的3个,其中Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。

miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。

半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达及酶活性研究

【目的】首次对半番鸭不同组织Cu/Zn-SOD基因表达、酶活性进行研究,以期了解半番鸭不同组织抗氧化特性,为深入研究半番鸭对环境因子的响应能力及相关分子机制提供参考。【方法】通过实时荧光定量法、黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分别测定了半番鸭心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌胃和胸肌中的Cu/Zn-SOD mRNA相对表达量、酶活力和MDA含量。【结果】Cu/Zn-SOD mRNA在胸肌中相对表达量最高,总体趋势为胸肌>肝脏>肺>心脏>脾脏>肾脏/肌胃。酶活力测定结果显示,肝脏和肾脏Cu/Zn-SOD酶活力显著高于胸肌和肌胃。半番鸭胸肌MDA含量显著高于肝脏、肌胃和肾脏,提示胸肌可能更易受到氧化应激损伤。相关分析结果显示Cu/Zn-SOD活力与MDA含量呈显著负相关,而抗氧化酶活力与mRNA表达水平相关性不显著。【结论】半番鸭Cu/Zn-SOD基因表达和酶活力具有组织特异性。不同组织Cu/Zn-SOD活力差异可能与Cu/Zn-SOD自身的生理功能以及组织代谢水平有关。

转棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因烟草的获得及其功能的初步验证

构建了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入NC89烟草,PCR、Southern blotting检测结果显示有4个烟草株系中整合了棉花叶绿体Cu/Zn-SOD基因,SOD酶活性测定结果显示4株转基因烟草植株SOD酶活性都明显高于非转基因烟草,离体叶片暗处理试验结果也证明四株转基因烟草比非转基因烟草SOD酶活下降速度明显减慢,百草枯喷施试验表明,转基因烟草都比非转基因烟草对百草枯的耐性增强,这一系列试验间接地说明外源基因的导入增强了烟草的耐衰老能力,本研究为今后利用SOD基因研究作物的早衰性状奠定了基础。

犬布氏杆菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为检测犬布氏杆菌(Brucella canis)重组Cu/Zn-SOD蛋白的抗原性,本研究通过PCR方法扩增B.canis的Cu/Zn-SOD基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-SOD。将该质粒转化受体菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约20 ku,以可溶性形式存在。经western blot分析表明,表达的重组蛋白可以与B.canis阳性血清发生特异性反应。表达的重组蛋白经纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,western blot分析表明制备的多克隆抗体可以与重组Cu/Zn-SOD蛋白发生特异性反应,表明Cu/Zn-SOD蛋白具有良好的抗原性。

吴茱萸Cu/Zn-SOD基因全长cDNA克隆与序列分析

目的:克隆获得与吴茱萸抗逆性密切相关的Cu/Zn-SOD基因cDNA全长序列。方法:采用RACE技术获得了该基因的开放阅读框(ORF)和3,5,端非编码区。结果:该基因全长717 bp,ORF区为459 bp,编码152个氨基酸,GenBank登录号为JQ285851。结论:该基因为吴茱萸Cu/Zn-SOD基因cDNA全长序列,与其它植物的Cu/Zn-SOD基因具有较高的同源性。

不同逆境胁迫下杉木Cu/Zn-SOD基因表达分析

逆境胁迫会对植物的生长发育产生影响,适度的胁迫会促进一些次生代谢产物的合成和积累,因而有利于品质的提高。逆境胁迫条件下,超氧化物歧化酶(SOD)介导的活性氧清除在维持植物体内活性氧稳态平衡,保护细胞免受活性氧伤害中扮演着关键角色。为揭示Cu/Zn-SOD基因在杉木逆境胁迫中的作用,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,分析杉木组培苗Cu/Zn-SOD基因在4℃低温、0.054 6 g·mL^(-1)甘露醇、2 mmol·L^(-1)铝离子和300 mmol·L^(-1)的Na Cl胁迫中的表达模式,同时探究SOD在不同处理下的活性变化规律。结果表明:在不同逆境胁迫下,杉木组培苗Cu/Zn-SOD基因均受到诱导,表达量总体呈现出先升高后降低的趋势。在4℃低温、干旱、铝离子和盐胁迫下,分别在48、48、16、24 h时达到最高,是对照的6.4、5.3、6.4、10.4倍,且与对照组相比,不同胁迫处理下Cu/Zn-SOD基因的表达量差异均达到显著水平,与该结果类似的是,SOD也发生不同变化趋势,但均高于对照组,推测可能存在SOD基因成员增加基因的表达量从而增加SOD含量。Cu/Zn-SOD基因在杉木组培苗逆境胁迫中发挥着重要的调控作用,为今后深入了解杉木Cu/Zn-SOD基因在逆境胁迫中的分子机制和杉木抗逆育种机理提供理论依据。

布鲁氏菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及其免疫原性分析

为分析布鲁氏菌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)蛋白的免疫原性,本研究将布鲁氏菌强毒株M28的Cu/Zn-SOD基因经PCR扩增并克隆至pET-32a(+)中进行重组表达和纯化。经western blot分析表明,重组蛋白SOD(rSOD)可以与布鲁氏菌自然感染血清发生特异性反应。同时,以rSOD免疫BALB/c小鼠制备的多抗血清可以与布鲁氏菌疫苗株M5-90发生特异性反应;以rSOD为包被抗原进行间接ELISA检测,结果显示rSOD能够区分布鲁氏菌阳性血清和阴性血清。因此,rSOD蛋白具有良好的免疫原性和ELISA反应原性,为利用rSOD蛋白建立布鲁氏菌检测方法奠定基础。

低氧-复氧胁迫对鲢抗氧化酶活性及Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表达的影响

为探究低氧-复氧胁迫对鲢(Hypophthalmichthys molitrix)抗氧化酶活性及Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表达的影响,对鲢进行急性低氧、持续低氧及复氧实验,进而分析血清、心脏和肝脏中不同抗氧化酶和SODs基因表达的变化特征。结果表明:在急性低氧胁迫后,血清中总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性随着氧浓度的降低均呈上升趋势,但超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升后降的趋势。在持续低氧胁迫后,血清中T-AOC和GSH-PX活性随着低氧胁迫时间的增加显著升高(P<0.05);心脏中SOD活性显著高于常氧水平(P<0.05),但Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表达在低氧胁迫24h时显著低于常氧水平(P<0.05);肝脏中SOD活性在低氧胁迫24h时显著高于常氧水平(P<0.05),且Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表达在低氧胁迫24h时也显著高于常氧水平(P<0.05)。复氧后,血清、心脏和肝脏中T-AOC、SOD、CAT和GSHPX活性均能恢复至常氧水平,且心脏和肝脏中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表达的也能恢复至常氧水平,但肝脏中Mn-SOD基因表达恢复至常氧水平较在心脏中所需时间更少。因而,鲢可以通过调节抗氧化酶的活性来保护自身免受氧化应激造成的损伤。研究为解析低氧胁迫下鲢抗氧化应激机制提供了基础。

哈密瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及生物信息学分析

依据NCBI中已克隆的葫芦科植物黄瓜和西瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,以哈密瓜果肉总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,最终获得一段403bp的哈密瓜Cu/Zn-SOD(HmCu/Zn-SOD)基因片段,运用Blast比对,系统进化树分析最终确定所克隆的基因片段为哈密瓜的Cu/Zn-SOD基因序列。运用蛋白质分析软件分析结果表明,克隆得到的哈密瓜Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和β-折叠等蛋白质二级结构元件构成,同时与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD的组成成分和理化性质具有高度的相似性。

丹参铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆与生物信息学分析

依据已构建的丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)cDNA文库和降落PCR的方法获得丹参胞质铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、亲水性/疏水性、二级结构以及功能等方面进行了预测和分析.结果表明,克隆得到的丹参Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD在序列组成、结构及活性位点等方面均有高度的相似性.

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。

荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证

以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、胚乳特异表达元件,且可能受WRKY和MYB等转录因子调控。通过双酶切方法,以ProLcCSD3替换载体pCAMBIA1301上的CaMv35S启动子,构建了重组质粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功转化农杆菌EHA105和GV3101。注射烟草的瞬时表达分析表明,该启动子片段可以驱动下游报告基因表达。转化拟南芥分析表明,该启动子驱动的下游GUS可以在拟南芥的根、茎、叶中表达,且可响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤等非生物胁迫。研究表明,荔枝古树LcCu/Zn-SOD3可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径。

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus)Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明,Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。

茶树花Cu/Zn-SOD酶活性及其基因表达分析

为研究Cu/Zn-SOD基因在茶树花不同发育阶段、不同品种间的表达规律以及Cu/Zn-SOD基因表达量与酶活性之间的关系,本研究将‘龙井43’品种茶树花分为4个发育阶段,选择15个品种的茶树花为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术对3个Cu/Zn-SOD基因表达水平进行定量分析,同时测定Cu/Zn-SOD酶活性。结果表明:在茶树花的4个发育阶段中,第4阶段Cu/Zn-SOD酶活性最低,与其他3个阶段具有显著差异;不同品种的茶树花Cu/Zn-SOD酶活性有较大差异,其中‘紫鹃’茶树花Cu/Zn-SOD酶活性最高,其次是‘黄金芽’和‘白叶1号’,‘黄观音’的Cu/Zn-SOD酶活性最低。茶树花不同发育阶段中Cu/Zn-SOD基因表达水平存在较大差异,细胞质型Cu/Zn-SOD1基因表达水平远高于叶绿体型Cu/Zn-SOD2和过氧化物酶体Cu/Zn-SOD3;不同品种茶树花Cu/Zn-SOD基因表达水平有较大差异,Cu/Zn-SOD1基因在‘黄牡丹’茶树花中表达量最高,Cu/Zn-SOD2基因在‘白叶1号’和‘黄观音’茶树花中表达量最高,Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鹃’茶树花中的表达量最高。相关性分析得知‘龙井43’茶树花不同发育阶段Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD基因表达量之间的相关性不明显,而不同品种茶树花的Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD3基因表达量存在显著相关性。本研究初步明确了Cu/Zn-SOD酶活性较高的茶树品种和茶树花适宜的采摘时间,为茶树花SOD进一步研究提供参考。

碱茅(Puccinellia tenuifolra)Put-Cu／Zn-SOD基因的克隆及在酵母中的表达

从碱茅根cDNA文库分离得到Put-Cu/Zn-SOD全长cDNA,其序列全长为2700bp,该基因的开放读码框为长615bp,所编码的蛋白由204个氨基酸组成,其预测分子量约为20.6kD、理论等电点约为5.63。Put-Cu/Zn-SOD氨基酸序列与水稻Cu/Zn-SOD序列有较高的同源性为87%。将Put-Cu/Zn-SOD基因构建到酵母表达载体pYES2,并转化至酵母(INVSc1)。对pYES2-Put-Cu/Zn-SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验。结果表明:重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照(pYES2转化酵母),结果显示了碱茅的Cu/Zn-SOD基因在酵母表达中,具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力。

转hCu,Zn-SOD突变基因聚球藻抗氧化作用的研究

目的研究转人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)突变基因聚球藻口服后的生物活性。方法给小鼠灌服转hCu,Zn-SOD突变基因聚球藻20d,然后测定小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活力以及丙二醛(MDA)含量。结果转hCu,Zn-SOD突变基因聚球藻可明显提高小鼠血清GSH-Px活力和全血血红蛋白CAT活性,显著提高小鼠血清和肝脏中Cu,Zn-SOD和总SOD(T-SOD)的活力,显著降低小鼠血清和肝脏的MDA含量。结论转hCu,Zn-SOD突变基因聚球藻有较强的抗氧化作用。

分泌癌胚抗原肿瘤靶向性Cu,Zn-SOD的基因克隆及表达

将 Cu,Zn- SOD与抗癌胚抗原 ( CEA)单链抗体基因 ( Sc Fv gene)融合 ,重组到含 T7启动子的表达载体 p ET- 2 2 b( + )中 ,构建表达质粒 p ETSOD- Sc Fv,并转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,进行高效表达 ,表达物占菌体可溶性总蛋白的 1 8%。SDS- PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达物相对分子质量为 41 k D,与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为分泌型表达 ,有利于纯化。RIA测定表明表达产物能特异性地与抗原 CEA结合 ,邻苯三酚法测定也表明表达产物具有 SOD酶的活性 ,该融合蛋白为分泌 CEA肿瘤的靶向性治疗及放疗。