东方山羊豆Cu/ZnSOD基因的克隆及表达分析

超氧化物歧化酶是一种广泛存在于真核生物中的金属酶类,在植物的抗逆性中起到重要的作用。文章采用RACE方法,从东方山羊豆中克隆了Cu/ZnSOD基因,并对其进行了初步分析。该基因cDNA序列全长935 bp,开放阅读框600 bp,编码199个氨基酸,蛋白质分子量为20.35 kDa。通过实时荧光定量PCR结果分析,该基因在东方山羊豆叶中表达量最多,茎中次之,根中最少。在NaCl和PEG诱导下,Cu/ZnSOD基因表达量先上调后下降。NaCl诱导24 h后,该基因的表达量显著低于对照。ABA胁迫抑制了该基因的表达。亚细胞定位结果表明,Cu/ZnSOD蛋白定位于叶绿体中。实验结果证明,Cu/ZnSOD基因主要在东方山羊豆的绿色组织中表达,在抵抗渗透性胁迫方面起到一定作用。

Cu/ZnSOD基因敲除小鼠——研究耳蜗氧化损伤的理想模型

目的 确定一个理想的耳蜗氧化损伤模型。方法 对 5只Cu/ZnSOD基因敲除纯合突变 (Cu/ZnSOD无活性 ,Sod1- / - )小鼠和 10只Cu/ZnSOD杂合突变 (5 0 %Cu/ZnSOD失活 ,Sod1+/ - )小鼠及 5只野生小鼠 (Cu/Zn SOD活性正常 ,Sod1+/ +)进行ABR检测及内、外毛细胞计数。应用PCR技术检测Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA缺失情况。结果 Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗内外毛细胞大量缺失 (P <0 .0 0 1) ,ABR检测 ,Sod1- / -小鼠ABR阈值在 8,16 ,32kHz及Sod1+/ -小鼠ABR阈值在 16 ,32kHz明显增大 (P <0 .0 0 1)。Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗mtDNA有三种缺失 ,分别为mtDNA 386 7bp、mtDNA 372 6bp及mtDNA 432 6bp缺失。结论 Cu/ZnSOD基因敲除小鼠耳蜗在细胞及分子水平上均表现出受到ROS损伤的改变 ,是一个理想的耳蜗氧化损伤模型。

超氧阴离子自由基诱导皮层神经细胞Cu/ZnSOD基因表达的研究

目的:探讨超氧阴离子自由基对神经细胞Cu ZnSOD基因表达的影响。方法:以产超氧阴离子自由基系统(XO X)作用于原代培养的新生大鼠大脑皮层神经元,分析SOD含量、SOD活性和SODmRNA丰度。结果:SOD含量随超氧阴离子自由基作用时间的延长显著增加,第5天后增加的变化趋于稳定,第7天达每毫克蛋白质(1 24±0 23)μg;SOD活性在开始的1～5d呈上升状态,第5天为每毫克蛋白质(5 30±0 44)U,第6天开始显著下降为每毫克蛋白质(2 15±0 32)U,且稳定至第7天的每毫克蛋白质(2 08±0 73)U;SODmRNA的相对丰度显著高于对照组。结论:超氧阴离子自由基可诱导培养的神经细胞Cu ZnSOD基因表达;SOD活性变化和SOD含量变化并不平行,可能是在超氧阴离子自由基作用一定时间后,细胞内出现了无活性或 和低活性的SOD。

林蛙油灌胃对小鼠肝组织中Cu/ZnSOD基因表达的影响

以小鼠为动物模型,通过直接灌胃的方法,验证不同剂量林蛙油抗氧化、抗衰老的作用;利用Realtime PCR的方法分析小鼠肝脏组织中与抗氧化相关基因Cu/ZnSOD的时空表达规律。结果表明,5周龄组和15月龄组小鼠灌胃林蛙油后,肝组织中Cu/ZnSOD基因表达量显著增加,但总体上看,5周龄鼠0.45 g·kg-1剂量组Cu/ZnSOD基因表达增加量要普遍高于2.25 g·kg-1剂量组,但与1.35 g·kg-1剂量组差异不显著;而15月龄鼠1.35 g·kg-1剂量组Cu/ZnSOD基因表达增加量要显著高于0.45和2.25 g·kg-1剂量组,但0.45和2.25 g·kg-1剂量组差异不显著;而且15月龄组Cu/ZnSOD基因表达量升高的速度较慢,一般在灌胃第30天或第45天才出现显著差异。

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp(GenBank登录号AY970822)和1 037 bp(GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA(GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA(GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blot分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。

转逆境诱导型启动子SWPA2驱动Cu/ZnSOD和APX基因甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)耐盐性

本研究以盐胁迫下逆境诱导型启动子SWPA2驱动转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯叶片一些生理指标的变化研究转基因甘薯耐盐性。结果表明:无胁迫时,转基因甘薯叶的生理指标与未转基因植株无明显差异。相同胁迫条件下,转基因甘薯叶的超氧化物歧化酶(SOD),抗坏血酸过氧化物酶(APX),过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT)活性均高于未转基因甘薯叶,尤以100mmol/LNaCl胁迫下差异最显著;转基因植株的根长也大于未转基因植株;转基因植株的叶绿素下降幅度和MDA含量则低于未转基因植株。这说明转基因甘薯具有一定的耐盐性。因此开发种植转基因耐盐甘薯对有效利用盐渍化土地和缓解能源危机有重大的意义。

西红柿CU／ZnSOD基因在大肠杆菌中高效表达的研究

利用带有Ｔｒｐ启动子的大肠杆菌表达载体ＷＣＣ８能有效地表达西红柿Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ基因，该表达蛋白在菌体中具有活性，并在一定程度上抑制受体菌ＳＯＤ基因的表达。据ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，表达ＳＯＤ蛋白占茵体总蛋白２０％左右，其活性达３．０×１０５Ｖ／Ｌ发酵液。还利用ＮＢＴ法对表达ＳＯＤ蛋白的活性进行了研究。

酿酒酵母Cu/ZnSOD基因的克隆和序列分析

超氧化物歧化酶（SOD）是一种十分重要的生物体防御氧化损伤的酶,其制品在医药、食品、化妆品等领域具有广泛应用前景,因此对SOD研究越来越受到学术界的广泛关注,而对微生物SOD的研究又具有特殊的意义和实际应用价值。故本研究对酿酒酵母Cu/ZnSOD基因进行克隆及序列分析,根据酿酒酵母Cu/ZnSOD基因登录号,成功扩增了Cu/ZnSOD基因的编码区序列,并对酿酒酵母Cu/ZnSOD基因的氨基酸序列、编码的蛋白质结构、亲疏水性以及同源进化树进行分析,结果显示,酿酒酵母Cu/ZnSOD基因编码区cDNA长度为462bp,编码154个氨基酸,位于10号（X）染色体622480bp到623090bp区域;Cu/ZnSOD编码的蛋白为亲水性蛋白;酿酒酵母Sod基因与粗糙脉孢菌、烟曲霉菌、白色念珠菌、汉逊德巴利酵母的Sod基因聚在同一个进化树分支上,说明它们的Sod基因之间可能具有较近的亲缘关系。Cu/ZnSOD氨基酸序列中并没有信号肽及跨膜结构域的的存在。本研究将有利于更深入的研究Cu/ZnSOD基因在防御氧化损伤中的关键作用,提高酿酒酵母SOD产率。

猪囊尾蚴铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)基因的克隆和表达

目的克隆猪囊尾蚴胞质含铜/锌的超氧化物歧化酶基因(Cu/ZnSOD),并比较其与其它寄生蠕虫相应基因结构的相似性。方法通过获取其它生物Cu/ZnSOD基因的保守区域,设计保守引物,用于扩增该寄生虫的Cu/ZnSOD基因。结果Cu/ZnSOD基因编码一15.6kDa的蛋白,该蛋白的推导序列中含有这类酶的活性和二级结构所需要的所有保守的氨基酸残基,并且与其它寄生虫的相应序列有高达70.6%的相似度。抑制剂研究试验表明所克隆的SOD属于Cu/ZnSOD,该蛋白在大肠杆菌中得以成功表达,表达产物具有SOD活性。免疫印迹试验发现猪囊尾蚴Cu/ZnSOD对人不仅具有抗原性,而且与其它几种蠕虫的Cu/ZnSOD有广泛的交叉免疫反应。结论克隆并表达出猪囊尾蚴Cu/ZnSOD,它与其它寄生吸虫和绦虫的Cu/ZnSOD在氨基酸水平具有很高的相似度,因此是理想的广谱抗寄生虫药物和疫苗的靶蛋白,值得进一步研究。

芝麻Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的全基因组鉴定与分析

铜/锌超氧化物岐化酶(Cu/Zn-SOD)是植物体内非常重要的一种活性氧清除酶系统,本研究通过blast的方法,在芝麻全因组水平进行Cu/Zn-SOD的鉴定。结果显示,芝麻中含有4条Cu/Zn-SOD,分别命名为SiCSD1、SiCSD2、SiCSD3、SiCSD4。理化性质分析表明,4种蛋白质均为酸性蛋白质,除SiCSD3外,均为亲水蛋白。结构域分析发现,蛋白质均含有Cu/Zn-SOD特有的结构域和金属离子结合域,但都不具有跨膜结构和信号肽。亚细胞定位预测分析发现,SiCSD1-3均定位于叶绿体,SiCSD4除了叶绿体,也有可能定位于细胞质。进化树分析发现,SiCSD3与拟南芥AtCSD2聚为一支,SiCSD4与拟南芥AtCSD3聚为一支,SiCSD1和SiCSD2与烟草NpSODC、番茄SlSODC1和SlSODC2聚在一个大的分支。以上结果初步表明,SiCSD1-4具有Cu/Zn-SOD共同的理化性质,其序列的鉴定将为后续功能的研究打下基础。

东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的克隆及序列分析

[目的]对东亚砂藓(Rhacomitrunm japonicum)的Cu/Zn SOD基因进行克隆,并对其序列进行分析。[方法]利用RT-PCR技术获得东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的cDNA,同时对该序列进行生物信息学分析。[结果]东亚砂藓Cu/Zn SOD基因cDNA长565 bp,包含一个长为465 bp的ORF,编码154个氨基酸残基,预测的该蛋白的分子量为15.5 kD,理论等电点为5.77,负电荷残基(Asp+Glu)总数为18个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为12个,不稳定系数是13.36;其编码的氨基酸序列包含了5个蛋白保守区,均为铜锌超氧化物歧化酶超家族所有;Blastn比对表明东亚砂藓Cu/Zn SOD基因与毛尖紫萼藓、小立碗藓相关基因的同源性高达99%和82%。[结论]该研究为进一步研究紫萼藓科植物的抗旱性及苔藓Cu/Zn-SOD在抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据与基础。

日粮纳米锌水平对公羊睾丸和附睾Cu-ZnSOD表达的影响

旨在研究日粮纳米锌对公羊睾丸和附睾铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu-ZnSOD)mRNA和蛋白表达的影响。将16只9月龄体重相近、健康状况良好的晋中绵羊公羊随机分成4组,分别喂给基础日粮(对照组),基础日粮+纳米锌(50、100和150mg·kg-1 DM)。预饲期10d,正试期80d。试验结束时采集绵羊睾丸和附睾组织。采用RT-PCR、Western blotting和免疫组化技术检测其Cu-ZnSOD mRNA、Cu-ZnSOD蛋白表达及在睾丸中定位情况。结果显示:绵羊睾丸和附睾组织Cu-ZnSOD mRNA表达量顺序是附睾头≥睾丸>附睾体>附睾尾。日粮添加50~100mg·kg-1纳米锌可增加其睾丸和附睾组织Cu-ZnSOD mRNA和蛋白表达量。免疫组化结果显示CuZnSOD在睾丸的生精细胞中有强阳性信号,间质细胞有弱阳性信号。综上表明,绵羊睾丸和附睾不同区段CuZnSOD mRNA和蛋白表达有差异。日粮添加适量锌可提高睾丸和附睾中Cu-ZnSOD mRNA和蛋白表达量,其作用机制仍需进一步研究。

纳米锌水平对公羊精液品质、抗氧化酶活性及附睾Cu-ZnSOD表达的影响

【目的】微量元素锌是动物正常繁殖所必需的元素,研究旨在了解日粮纳米锌对公羊精液品质、抗氧化酶和附睾Cu-Zn SOD蛋白表达的影响,分析公羊精液品质参数与精浆抗氧化酶活性的相关性。【方法】将16只9月龄健康状况良好体重相近的晋中绵羊公羊,随机分成4组,分别喂给基础日粮(对照组),基础日粮+50 mg·kg-1、100 mg·kg-1和150 mg·kg-1DM纳米锌。试验期90 d。在试验78 d和79 d连续两天采集精液,每次采集精液取出100μL评价精液品质参数,剩余精液离心分离精浆,测定精浆Cu-Zn SOD、GPxs活性及总抗氧化能力;试验结束时,用手术去势法采集附睾头、附睾体和附睾尾组织,采用免疫组化技术对附睾头、附睾体和附睾尾中Cu-Zn SOD进行定位,并用Image Pro Plus 7.0软件分析的平均光密度值进行Cu-Zn SOD蛋白定量。【结果】日粮纳米锌对公羊射精量影响差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,添加50 mg·kg-1或100 mg·kg-1纳米锌组公羊的精子密度、精子活力和精子质膜完整性显著增加(P<0.05),精子畸形率显著降低(P<0.05);添加150 mg·kg-1组精子质膜的完整度显著增加(P<0.05),其精子活力和精子密度与对照组的差异不显著(P>0.05)。日粮添加50 mg·kg-1或100 mg·kg-1纳米锌组公羊精浆Cu-Zn SOD活性、GPxs活性和总抗氧化能力显著高于对照组(P<0.05),精浆MDA含量显著低于对照组(P<0.05);添加150 mg·kg-1组公羊精浆总抗氧化能力显著高于对照组(P<0.05),其精浆Cu-Zn SOD活性、GPxs活性和MDA含量与对照组差异不显著(P>0.05)。免疫组化定位结果显示Cu-Zn SOD在附睾头和附睾体假复层上皮、结缔组织和附睾尾的单层柱状上皮中均检测到阳性信号,试验处理组公羊附睾中Cu-Zn SOD表达量由高到低顺序是:附睾体>附睾头>附睾尾;然而对照组的顺序为:附睾头>附睾体>附睾尾。50 mg·kg-1或100 mg·kg-1纳米锌组公羊附睾头和附睾体阳性信号的平均光密度显著高于对照组和150 mg·kg-1纳米锌(P<0.05)。精浆Cu-Zn SOD活性与精子密度、精子活力和精子质膜完整性呈正相关,与精子畸形率呈负相关。【结论】日粮添加50 mg·kg-1或100 mg·kg-1纳米锌可改善精液品质,提高精浆抗氧化能力,增加附睾中Cu-Zn SOD蛋白表达量。精浆Cu-Zn SOD活性可以作为检测精液品质优劣的指标在羊生产中应用。微量元素锌对精液品质影响调控的分子机理还需进一步深入研究。

Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化。经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草。进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达。对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性。

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus)Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明,Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。

哈密瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及生物信息学分析

依据NCBI中已克隆的葫芦科植物黄瓜和西瓜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,以哈密瓜果肉总RNA为模板,通过RT-PCR扩增,最终获得一段403bp的哈密瓜Cu/Zn-SOD(HmCu/Zn-SOD)基因片段,运用Blast比对,系统进化树分析最终确定所克隆的基因片段为哈密瓜的Cu/Zn-SOD基因序列。运用蛋白质分析软件分析结果表明,克隆得到的哈密瓜Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和β-折叠等蛋白质二级结构元件构成,同时与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD的组成成分和理化性质具有高度的相似性。

杨梅Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(MrSOD1)cDNA的克隆及表达分析

以杨梅叶为材料,利用RT-PCR技术克隆Cu/Zn超氧化物歧化酶基因,并利用半定量RT-PCR方法分析该基因在不同组织中的表达。获得1个杨梅Cu/ZnSOD基因编码区全长cDNA序列,长度为461bp,编码一个由152个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质具有Cu/ZnSOD的特征信号序列;序列同源性分析表明,其与GenBank中注册的Cu/ZnSOD序列的同源性均在77%以上。该基因命名为MrSOD1(GenBank登录号:GQ404510)。半定量RT-PCR分析显示,MrSOD1在4种组织中表达量为:果>叶>花>枝条。本试验为进一步研究MrSOD1的时空表达特性、调控途径及杨梅抗氧化伤害的分子机理奠定基础。

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。

Cu^(2+)、Cd^(2+)胁迫对小麦幼根SOD活性及其基因表达的影响

采用水培试验探索不同浓度(0 mg/L、5 mg/L、30 mg/L和60 mg/L)Cu2+或Cd2+胁迫(24 h、48 h、72 h和96 h)后对小麦幼根超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响,并通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real-timefluorescence quantitative PCR,Real-time Q-PCR)检测Cu/ZnSOD基因表达。结果表明,Cu2+胁迫处理72 h后,各处理SOD活性均较对照极显著提高(P<0.01),且30 mg/L浓度下SOD酶活性最高,是对照的3.67倍;而Cd2+胁迫处理后,幼根SOD活性整体呈现"升-降-升"的趋势,胁迫前期酶活性的降低程度与Cd2+浓度成正比,至72 h酶活性最低。Cd2+胁迫条件下Cu/ZnSOD的表达量明显高于Cu2+胁迫。不同时间Cu2+胁迫下,Cu/ZnSOD基因表达均呈现5 mg/L浓度处理高于60 mg/L和30 mg/L,表明低浓度促进而高浓度抑制该基因表达;而对于Cd2+胁迫,Cu/ZnSOD基因随浓度的升高和时间的延长呈现明显下降趋势,至96 h最低。本实验结果表明,Cu2+、Cd2+胁迫处理后浓度对基因表达的影响较大。该结果为深入探讨重金属胁迫下小麦幼根中SOD特性的研究提供理论参考和技术支持。

miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。