转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。

转基因大豆GTS 40-3-2品系特异性环介导等温扩增法检测方法的建立与应用

根据外源插入序列与大豆内源基因边界序列,用设计软件Primer Explorer Version 3设计并筛选了转基因大豆GTS 40-3-2品系的环介导等温扩增引物,并进行了反应体系和反应条件的优化,建立了转基因大豆GTS 40-3-2品系特异性环介导等温扩增检测方法。对该方法进行了特异性、灵敏度、稳定性评价,结果显示:该方法能够特异、稳定、灵敏地检测大豆及其制品中的转基因大豆GTS 40-3-2成分,检测低限达到0.5%。此外,对12份实际样品的检测结果表明,该方法与实时荧光PCR方法的检测性能相当,结果吻合率为100%,假阳性率和假阴性率均为0。

可见光检测-低压离子色谱法测定Fe^(3+)、Cu^(2+)、Zn^(2+)、Fe^(2+)

利用低压离子色谱柱,选用酒石酸-柠檬酸混合液作为洗脱体系,将Fe3+、Cu2+、Zn2+、Fe2+四种离子完全分离,柱后采用2-[(5-溴-2-吡啶)-偶氮\〗-5-二乙氨基苯酚(5-Br-PADAP)进行衍生反应,于波长560nm处进行检测。四种离子的检出限分别为0 14mg/L,0 006mg/L,0 003mg/L,0 05mg/L。方法用于实际样品分析,取得满意的结果。

McAb夹心法ELISA检测血清单纯疱疹病毒2型糖蛋白gC型特异性抗体

建立了检测单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白gC型特异性抗体的方法。用本法同免疫荧光血清分型,抗原竞争ELISA和微量中和实验(MNT)进行了比较,检测HSV-2抗体的感度均优于后3种方法。实验结果表明:本法特异、敏感、简便。不仅可用于区分人群中HSV感染型别的流行病学调查,也适用于HSV-2糖蛋白gC的特异性研究。

基于碳量子点的Cu^(2+)检测的创新实验设计

以谷氨酸为碳源,采用一步水热法制备碳量子点并将其制成检测试纸。通过检测试纸与溶液中金属铜离子的荧光增强作用,从而快速定性地检测出Cu^(2+)的浓度,该检测试纸具有良好的抗干扰性和选择性。该实验从材料合成到应用的完整流程,有利于材料专业相关学生对于材料合成方法、相关表征手段的认识,有利于激发学生在实验教学活动中的学习热情,掌握相关的专业知识。

Anoctamin家族中钙激活氯离子通道调节剂筛选及应用研究进展

钙激活氯离子通道(CaCC)是一类能通过胞内钙离子激活转运氯离子的通道蛋白,其主要在神经元和肌细胞中参与调节膜电位、细胞内钙平衡和细胞兴奋性等重要的生理作用。Anoctamin(Ano)家族中Ano1是最经典的CaCC,Ano1的靶向调节剂对癌症、囊性纤维化、高血压、腹泻和哮喘等疾病具有潜在治疗作用。自2008年Ano1首次被发现后,先后出现了多种CaCC特异性调节剂的筛选方法,主要包括基于荧光蛋白的高通量初级筛选、电生理膜片钳技术和虚拟筛选,进而发现了多种药理学作用不同的小分子调节剂。本文综述了目前较为主流的筛选方法的原理和优缺点,并对迄今发现的Ano1特异性调节剂的化学结构和潜在的应用进展进行综述。

一种用于Cu^(2+)检测的裸眼可视探针的研究及应用

研究了一种裸眼可视Cu^(2+)离子荧光探针在15种金属离子中对Cu^(2+)离子选择性。进一步探讨了探针的灵敏度和作用后的红外光谱图,推测其作用机理为探针在Cu^(2+)存在的情况下探针CuP的C和N相连的双键断裂形成螯合物,从而实现水溶液中Cu^(2+)的裸眼可视检测。

松材线虫rDNA-ITS2的Taq Man探针实时荧光PCR检测

以松材线虫rDNA -ITS2为靶区 ,建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明 ,探针检测松材线虫和拟松材线虫时 ,前者产生明显的荧光信号 ,后者无荧光信号 ,表明探针具有高度的特异性 ;探针检测到最低模板浓度为 1pg·μL- 1 。

血清HER-2/neu、TPS、CA15-3和TSGF联合检测在乳腺癌诊断中的价值

目的:探究乳腺癌患者血清中人表皮生长因子受体2(HER-2/neu)、组织多肽特异性抗原(TPS)、糖类抗原15-3(CA15-3)和肿瘤特异性生长因子(TSGF)联合检测在乳腺癌诊断中的价值。方法 :采用化学发光免疫分析法检测48例乳腺癌患者、46例良性乳腺疾病患者以及50例健康女性血清中HER-2/neu、TPS、CA15-3和TSGF水平。结果 :乳腺癌组HER-2/neu、TPS、CA15-3及TSGF水平均显著高于良性疾病组及健康对照组(P<0.01),而良性乳腺疾病组4项肿瘤标志物浓度水平与健康对照组比较均无统计学差异(P>0.05);HER-2/neu、TPS、CA15-3和TSGF联合检测灵敏度明显高于各单项检测灵敏度。结论:单项肿瘤标志物检测在乳腺癌诊断中的应用价值不高,而HER-2/neu、TPS、CA15-3和TSGF联合检测有助于提高乳腺癌的诊断灵敏度,对乳腺癌具有较高的诊断价值。

猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的研究

本研究介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增(LAMP)基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中2对特殊引物,并在Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应。本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV-2 LAMP在63℃1 h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明,本研究能够特异的检测PCV-2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,初步研究LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为94%符合。以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简便、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力。

联合检测血清CA199、FPSA、β_2微球蛋白对前列腺癌的临床诊断价值

目的探讨血清糖类抗原199(CA199)、游离前列腺特异性抗原(FPSA)、β2微球蛋白(β2MG)联合检测的临床价值。方法对本院2007年1月～2011年8月收治的57例前列腺癌患者及同期62例健康体检人员血清CA199、FPSA、β2MG的含量进行回顾性调查。结果两组血清CA199、FPSA、β2MG含量差异具有统计学意义(P<0.01),且前列腺癌患者组较高,前列腺癌患者单项检测血清CA199、FPSA、β2MG的阳性率分别为80.7%、96.49%和66.67%,特异性分别为95.16%、96.77%和91.94%;三项联合检测阳性率与特异性分别为98.25%和98.39%,均高于单项检测。结论联合检测血清CA199、FPSA、β2MG对鉴别诊断前列腺癌有较高的临床价值。

离子掺杂对纳米TiO2薄膜光催化活性的影响研究

研究了Ag^+、Cu^2+、La^3+、Ni^2+及W^6+ 5种离子掺杂对釉面瓷砖表面TiO2薄膜光催化活性的影响，并采用XRD和UV—VIS检测技术对所制备的TiO2薄膜材料进行了表征。结果表明，掺杂离子能有效提高TiO2薄膜的光催化活性，且离子的掺杂存在一个最佳浓度。UV—VIS及XRD衍射发现，掺杂后的纳米TiO2薄膜有不同程度的吸收光谱带边蓝移及粒径减小的现象，具有量子尺寸效应。

抗CD20嵌合抗体的表达与活性检测

表达了基因重组抗CD20嵌合抗体并对其生物学活性进行了初步鉴定。设计合成轻、重链可变区序列;提取血液RNA,通过RT-PCR得到人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列。运用重叠延伸PCR,连接可变区与恒定区,将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体。将质粒以阳离子脂质体转染CHO细胞,ELISA挑选阳性克隆,共获得7株表达较高的克隆,表达量约为2mg/L。扩大培养阳性克隆anti-CD20-1B3,收获上清,以蛋白A进行亲和层析纯化表达蛋白。SDS-PAGE检测表明纯化纯度达到95%,蛋白相对分子量与理论值吻合。以CD20+细胞Raji、Daudi、Ramous检测,表明该抗体能与CD20抗原特异性结合,体外杀伤试验说明抗体能够杀伤CD20+淋巴瘤细胞。

基于表面等离子体共振原理的核酸检测技术

目的建立基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)生物传感器的核酸检测技术,为实时、在线检测航天微生物奠定技术基础。方法应用本实验室建立的便携式生物分子在线分析系统(portable online bio-molecules analyzer,POBA),在传感器表面固化探针分子,对溶液中的靶序列进行杂交检测,研究该检测方法的灵敏度、特异性及可重复性等。结果实验中建立的核酸检测方法能够实现对靶序列的实时检测,检测下限达2.3nmol/L,进行9次杂交检测的变异系数为3.5%,重复进行30次检测的变异系数为14.7%。结论本实验建立的核酸检测方法,具有灵敏度高、特异性强、可重复性好等优点,SPR传感器技术在核酸杂交检测工作中有着广阔的应用前景。

80例毛细支气管炎患儿血清sIL-2R、ECP和sIgE的检测

目的:探讨毛细支气管炎患儿血清可溶性白介素-2受体(sIL-2R)变化的临床意义。方法:应用ELISA测定急性毛细支气管炎发作期80例、哮喘急性发作期23例、健康对照组17例血清sIL-2R水平;同时uniCAP100变态反应检测仪测定血清嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)、特异性IgE(sIgE)。结果:急性毛细支气管炎发作期与哮喘急性发作期sIL-2R水平均高于对照组(P<0.01),两患病组间无差异(P>0.05),毛细支气管炎发作期sIL-2R水平的增高与血清ECP的增高、sIgE阳性无关。结论:毛细支气管炎发作期sIL-2R水平增高是普遍的,T细胞激活参与疾病的免疫病理机制。

转基因大豆GTS40-3-2成分现场可视化检测方法的建立

转基因大豆GTS40-3-2转化体是种植面积最广的转基因大豆品种,根据GTS40-3-2转化体特异性序列设计引物,应用可视化环介导等温扩增技术,对其进行快速扩增及可视化判断;同时建立转基因成分人工污染的食品模型,比较了LAMP法与定性PCR方法检测的敏感性。结果表明:该方法仅对GTS40-3-2转化体产生特异性扩增,灵敏度高达0.001%。所建立的GTS40-3-2转化体特异性现场可视化筛查方法具有较高的特异性与灵敏性,操作简单、快速,可用于转基因大豆GTS40-3-2成分污染的现场可视化检测。

汉回蒙古族人MBLExonⅠ52位基因频率检测及其意义

目的初步调查健康汉族人、蒙族人及回族人MBL52位密码子基因突变的情况。方法采用MBL52位密码子基因突变的序列特异性引物聚合酶链式反应即PCR-SSP检测方法。结果检测169例健康汉族人52位密码子的点突变情况,野生型为161例,占95.3%;突变杂合型为8例,占4.7%。基因频率分别为CGT为0.976;TGT为0.024。检测58例蒙族人,野生型为58例,占100%。基因频率CGT为1。检测100例回族人,野生型为100例,占100%。基因频率CGT为1。组间比较采用χ2检验,P<0.05;汉族与蒙族人比较,P>0.05,汉族与回族人比较,P<0.05。结论ExonⅠ52位密码子的点突变频率不高,汉族与蒙族人没有显著性差异,汉族与回族人有显著性差异。

亲和层析法纯化系统性红斑狼疮特异性60KDRo/SSA抗原

目的:建立亲和层析法纯化Ro/SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法:从猪脾提ENA(可提取核抗原),以硫酸铵沉淀、离子交换层析进行初步纯化。挑选单纯抗60KDSSA抗体阳性的病人的血清,制备亲和层析柱。用ELISA法检测所制备的抗原。结果: 60KDSSA抗体阳性标准血清ELISA检测为阳性,Sm和RNP、Jo-1、Scl-70的标准抗血清为阴性。结论:该方法可获得高纯度的抗原,可用于ELISA检测等目的。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。