瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus)在湖南省的首次报道及其流行动态研究

瓜类褪绿黄化病毒Cucurbit chlorotic yellows virus（CCYV）属长线形病毒科（closteroviridae）毛形病毒属（crinivirus）,在世界范围内给蔬菜生产造成了严重危害,病毒侵染造成果实重量减轻10%-33%,产量减少10%-12%。CCYV不能靠摩擦接毒,只能由烟粉虱以半持久方式传播,

瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白的亚细胞定位及致病作用浅析

瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)是近些年来出现的一种烟粉虱Bemisia tabaci传播的植物病毒,在瓜类生产中造成了严重损失。为了解该病毒外壳蛋白(coat protein,CP)在病毒侵染寄主过程中的亚细胞定位和致病作用,本研究以CCYV山东黄瓜分离物为研究对象,构建了荧光表达载体CP-YFP和异源表达载体pGR-CP。浸润荧光表达载体48 h后的本氏烟Nicotiana benthamiana叶片在激光共聚焦显微镜下可以观察到荧光信号在细胞质和细胞核内均有分布;浸润异源表达载体的本氏烟植株7 d后上部叶片开始显现花叶症状,13 d后顶部新叶出现严重皱缩和坏死斑点。以上结果表明CCYV CP蛋白参与了病毒对寄主的侵染过程,可能是症状形成的致病相关因子。本研究为进一步解析该病毒的致病机理提供了初步的理论支持。

海南省和河南省发生甜瓜褪绿黄化病的分子鉴定

【目的】为了探明引起海南省和河南省甜瓜褪绿黄化的病因,【方法】提取从海南三亚和河南郑州采集的甜瓜叶片的RNA,用CCYV特异性引物进行外壳蛋白基因的克隆、测序,并与GenBank中同属或同种病毒的cp基因核苷酸序列构建系统进化树。【结果】结果显示,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,所得条带在880 bp左右,与预期的一致;构建cp基因的系统进化树发现,样品与瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)的亲缘关系很近,属于同一个分枝,而与该病毒同属不同种的南瓜黄矮失调病毒(Cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV)和大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV)的亲缘关系较远,属于不同的分枝。【结论】证实海南省和河南省甜瓜褪绿黄化病是由瓜类褪绿黄化病毒引起。

广西三种甜瓜病毒分离物的分子检测与鉴定

瓜类褪绿黄化病毒Cucurbits chlorotic yellows virus(CCYV)、甜瓜黄化斑点病毒Melon yellow spot virus(MYSV)及甜瓜坏死斑点病毒Melon necrotic spot virus(MNSV)是近年来报道侵染瓜类作物的新病毒,在个别种植区大面积发生,对生产构成严重威胁。为了解3种病毒在广西的发生情况,先后到各西甜瓜种植区进行了调查,并采集疑似CCYV、MYSV及MNSV的甜瓜病叶样品,提取病叶总RNA,通过特异性引物分别进行一步法RTPCR扩增,电泳结果显示RT-PCR产物与预期大小一致的序列条带;将扩增产物分别连接到pMD19-T克隆载体上,挑选阳性克隆子进行序列测定及比对分析。结果表明:CCYV、MYSV和MNSV广西分离物的CP基因序列与其他已报道核苷酸序列一致性分别达95.1%~100%、96.5%~99%和83.7%~92.5%。

瓜类新病毒病害(一):瓜类褪绿黄化病

介绍了我国最新发现的瓜类病毒病害—瓜类褪绿黄化病的症状、分布、病害发现历史,病原、寄主范围、传播途径和综合防治措施,并指出未来针对该病害需要开展的研究内容。

甜瓜褪绿黄化病的发生与传毒介体烟粉虱群体数量关系的调查

为研究瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)的传播介体烟粉虱对该病害发生的影响及不同甜瓜品种对CCYV的抗性,笔者调查了整个甜瓜生长季节中烟粉虱的发生动态、病害的发生情况、控制烟粉虱对病害发生的影响及不同甜瓜品种的发病情况。结果表明,烟粉虱的发生群体数量是影响甜瓜褪绿黄化病发生的最主要因素,不同品种间也存在明显的抗病性差异。因此,在甜瓜生产中有效地控制烟粉虱是控制该病害的关键。

瓜类新病毒病害(三):甜瓜黄化斑点病

介绍了我国最新发现的瓜类病毒病害——甜瓜黄化斑点病(图版见彩色插页第26页)的症状、分布、病原及基因组、寄主范围、传播途径、病毒检测及防治等内容。

甜瓜病叶CCYV积累量与叶片症状表现的相关性研究

采集瓜类褪绿黄化病毒侵染的甜瓜叶片,通过半定量RT-PCR的方法分析了不同的症状表现与病毒量的相互关系.结果表明,症状表现为黄化和重花叶的甜瓜叶片病毒含量基本一致,症状表现为轻花叶的甜瓜叶片中病毒含量显著高于其他2种叶片.

瓜类褪绿黄化病毒及其系统进化分析

【目的】检测新疆南疆7个县/市瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV),进行系统发育分析,为新疆南疆CCYV预警和防控提供参考。【方法】于2019年,从中国新疆南疆7个县/市采集带有黄化特征的51份甜瓜叶片样品,RT-PCR进行CCYV的检测,进行特异性片段的克隆、测序和系统发育分析。【结果】中国新疆巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县、疏勒县、疏附县均未检测到CCYV,而洛浦县的13份样本中,8份检出为CCYV阳性,检出率为61.53%,洛浦县CCYV特异性片段克隆测序获得了685 bp的核酸序列,与GenBank中的CCYV分离物外壳蛋白(Coat protein,CP)的一致性达到100%。所得序列与中国新疆(吐鲁番)、中国其他省、苏丹、日本、塞浦路斯、黎巴嫩的CP基因聚在I组(Group),沙特阿拉伯的分离物聚在Ⅱ组,伊朗的分离物聚在Ⅲ组。【结论】CCYV在中国新疆南疆洛浦县甜瓜产区发生,与中国新疆吐鲁番、中国其他省及周围国家的CCYV分离物亲缘关系很近,且群体遗传变异很小。

山东寿光黄瓜上瓜类褪绿黄化病毒的分子鉴定

2016年,本研究在对山东黄瓜病毒病调查时发现当地黄瓜上出现一种叶片表现黄化植株伴有轻微矮缩的病害,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间病样进行了采集,提取总RNA后利用瓜类病毒引物进行RT-PCR检测,结果发现在利用瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)引物检测样品时,田间采集的25份疑似病样中13份能扩增到400 bp左右的目的条带。为进一步确认,我们又针对CCYV的外壳蛋白基因(CP)设计了特异性引物,对13份阳性样品进行检测,结果均能扩增到目的片段,对获得的CP基因片段进行克隆并测定序列,序列分析结果显示其CP基因序列全长753bp,编码1个由250个氨基酸组成的分子量28700的蛋白质。进一步序列分析结果显示其与CCYV已报道分离物有很高的同源性,并聚类到同一个大的分支,其中与日本分离物、希腊分离物及中国其他地区分离物相对近缘,聚类到一支,而与伊朗分离物近缘关系相对较远。这些结果说明山东黄瓜黄化病样上检测到的病毒为瓜类褪绿黄化病毒,这也是该病毒在山东侵染黄瓜的首次报道。

与瓜类褪绿黄化病毒P22蛋白互作的寄主因子的筛选

为阐明瓜类褪绿黄化病毒(CCYV)的侵染机制,筛选与P22互作的寄主因子。采用免疫沉淀技术结合质谱分析共获得128个寄主蛋白。KEGG分析发现,所获得的寄主因子主要参与到寄主体内的碳水化合物代谢、能量代谢以及信号转移等代谢途径中。将所获得的128个基因进行GO分析,发现筛选到的与P22蛋白相互作用的寄主蛋白分为39个功能组,分别属于生物过程、分子功能和细胞组分三大类别。在生物过程类别中光合作用、蛋白质折叠、葡萄糖代谢过程及碳代谢过程为主要功能组。在分子功能类别中,ATP结合和金属离子结合为主要功能组。在细胞组分类别中生物膜、细胞质和光系统Ⅱ氧化复合体为主要功能组。结合质谱分析结果,根据富集肽段数目和蛋白质功能筛选出8个候选寄主蛋白。KEGG数据库分析表明,8个候选寄主蛋白可能参与或涉及的代谢通路大类可以归为碳水化合物代谢、能量代谢以及信号转移等3个代谢途径。利用酵母双杂交验证8个寄主因子与P22互作。结果表明,甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(GAPDH-A)能够与P22蛋白在酵母中互作,推测P22可能影响寄主抗性并参与寄主黄化症状的产生。筛选鉴定了与P22互作的寄主因子,为阐明P22蛋白在CCYV侵染过程中的作用机制奠定了基础。

瓜类褪绿黄化病毒快速检测技术的引物筛选与体系优化

【目的】瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)是近年来发生的、由烟粉虱Bemisia tabaci半持久性传播的一种植物病毒,给瓜类作物带来严重经济损失。PCR扩增是检测该病毒的常用技术,但目前已报道引物对靶标生物的检测存在扩增结果不稳定、重复性不够的问题。本研究旨在通过筛选多对引物并优化PCR条件获得适合于稳定检测的引物及扩增体系。【方法】以携带有CCYV的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101菌株菌液及其侵染获得的CCYV阳性黄瓜叶片cDNA为检测对象,从14对PCR引物中筛选出可用于稳定检测CCYV的引物,同时进行退火温度的优化;以携带有CCYV的根癌农杆菌侵染的阳性黄瓜叶片cDNA为模板,对筛选出来的4对引物及退火温度进行PCR扩增的稳定性和灵敏度检测;利用4对优选PCR引物对13份采自田间的烟粉虱成虫及寄主植物叶片的感毒状况进行检测和验证。【结果】从已报道的14对引物中筛选出4对引物可同时对携带CCYV的根癌农杆菌GV3101菌液及其侵染的CCYV阳性黄瓜叶片cDNA进行稳定扩增,并获得最优的扩增程序。灵敏度检测结果显示,优选的4对引物可检测到CCYV的最低黄瓜叶片cDNA浓度为0.25 ng/μL。利用优选的4对引物通过PCR对13份采自田间的烟粉虱成虫及其寄主植物叶片的CCYV检测发现,测试样本的CCYV阳性率为69.23%。【结论】优选的4对引物及其对应的优化扩增程序可用于对携带有CCYV的根癌农杆菌及其侵染的植物叶片以及田间样本是否感染CCYV的检测。

瓜类蚜传黄化病毒在南疆的检测及系统进化

2019年从南疆7个县/市采集表现瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)侵染典型特征的47份甜瓜叶片样品,通过RT-PCR进行CABYV的检测,从县/市各选出1份代表性样本,进行特异性片段的克隆、测序,以及核苷酸多样性、蛋白序列和系统发育分析。结果显示,28份样本呈现CABYV阳性,检出率为59.57%,巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县、疏勒县、疏附县、洛浦县的检出率分别为80.00%、28.57%、83.33%、60.00%、37.50%、71.42%、66.67%。克隆测序获得了707 bp的核酸序列,核苷酸多样性值在0.012~0.018之间,所有序列均具有2个开放阅读框(ORF)。ORF1编码199个氨基酸的外壳蛋白(CP),各县/市的序列相似性为99.07%。ORF2编码191个氨基酸的运动蛋白(MP),各县/市的序列相似性为98.80%。基于CP和MP序列构建的系统发育树表明,各县/市得到的所有CP和MP均聚在亚洲分支。CABYV在南疆甜瓜主产区普遍发生,且不同区域核苷酸变异很低,这些地区的CABYV与中国及日本分离物的亲缘关系较近,而与欧洲及中国台湾分离物的亲缘关系较远。

瓜类褪绿黄化病毒对黄瓜叶片营养及防御反应的影响

研究了由烟粉虱(Bemisia tabaci)半持久性传播的瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus;CCYV)对黄瓜叶片营养物质含量和重要防御物质及防御相关基因的影响。采用蒽酮、福林酚等化学显色法测定了感染CCYV和健康黄瓜植株在5 d及15 d可溶性糖、游离氨基酸、总酚、单宁的含量,采用qRT-PCR测定了3种参与水杨酸或茉莉酸途径的抗病防御基因(PR1,PR3和CAT)在感染CCYV不同时间点的变化。试验结果表明,CCYV显著降低了黄瓜叶片防御物质总酚、单宁的含量,同时可溶性糖和游离氨基酸等营养物质含量也显著降低。防御性物质的降低有利于介体昆虫的韧皮部取食行为,能够促进介体昆虫的获毒和传毒效率,而营养物质含量的降低可能是驱动介体昆虫获毒之后转移寄主的因素之一。感染CCYV 5 d和15 d的黄瓜植株PR1基因表达均显著下调;而PR3基因在5 d时表达显著下调,但在15 d时与健康植株表达差异不显著;CAT基因表达量在感染CCYV 5 d和15 d均显著上调。这说明CCYV可能以不同的方式调控植物的防御反应基因。

黄瓜瓜类蚜传黄化病毒的检测与分析

黄瓜是我国重要的蔬菜种类之一,目前已报道约36种病毒可侵染黄瓜,其中瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)平均检出率为0.65%。2021年9月在甘肃省白银地区发生病毒病的黄瓜田,发现叶片呈现黄化、明脉症状黄瓜病株。为明确其病原,采集病株后,采用分子生物学方法对病样进行了检测。RT-PCR及病毒CP基因序列测定分析结果表明,该病样受到瓜类蚜传黄化病毒Cucurbit aphid-borne yellows virus(CABYV)的感染。这是继2017年在甘肃酒泉市瓜州县的甜瓜上检测到CABYV后,在甘肃白银市靖远县的黄瓜上再次检测到该病毒。

甜瓜瓜类蚜传黄化病毒侵染响应基因鉴定

瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)是侵染甜瓜(Cucumis melo)等葫芦科作物的重要病毒之一,严重影响作物产量和品质。响应CABYV侵染的关键基因鉴定可为甜瓜抗病毒病育种提供靶基因。本研究用构建的CABYV侵染性克隆载体接种‘西州蜜’甜瓜,并对0 dpi(days post inoculation,感染后时间)、5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi时的甜瓜进行病情鉴定与转录组分析。结果表明:‘西州蜜’在20 dpi时表现出叶片明显褪绿、黄化和增厚等典型症状;基于转录组测序鉴定到响应CABYV侵染的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)为1654个,其中上调基因677个,下调基因977个。对这些响应基因进行基因本体(gene ontology,GO)与京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,发现其主要富集在植物-病原互作、光合作用、淀粉和蔗糖代谢、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢等途径和过程。差异基因共表达与互作分析发现,在CABYV侵染后,病原防御反应过程中的关键基因RIN4表达量呈下调趋势,推测其负调控甜瓜对CABYV的侵染响应。本研究结果为解析CABYV侵染甜瓜后基因响应的分子机制和甜瓜抗CABYV育种提供了重要依据。

安徽省太和县瓜类褪绿黄化病毒自然侵染南瓜的检测分析

采集安徽省太和县南瓜具有典型症状的病叶样品进行RT-PCR检测鉴定,并结合测序结果确定为CCYV。为了更加明确安徽太和地区CCYV的来源和序列的变异情况,测定了该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)序列进行系统发育分析,结果表明,此次安徽太和县所检测到的分离物与我国其他地区的分离物以及以色列、日本和希腊等国家存在较小的地域差异性,亲缘关系较近,而与伊朗地区的分离物亲缘关系相对较远。该研究是安徽省CCYV侵染南瓜的首次报道,以期为该病害的预警和防控提供理论基础和科学对策。

利用小RNA深度测序技术鉴定西瓜病毒病病原

西瓜是一种重要的园艺植物,近年来饱受病毒病危害。为明确西瓜病毒病害病原,对采自山西太谷区表现花叶、皱缩等症状的西瓜叶片进行小RNA深度测序,同时利用RT-PCR的方法并结合生物信息学的手段,综合分析造成西瓜花叶、皱缩症状的病毒病原。结果表明,表现皱缩、花叶症状的西瓜样品被瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)、甜瓜潜隐病毒(cucumis melo cryptic virus,CmCV)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)、西瓜皱叶病毒2号(watermelon crinkle leaf-associated virus 2,WCLaV2)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)5种病毒复合侵染。利用RT-PCR的方法分别扩增获得5种病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,进一步通过序列一致率分析和系统进化分析发现,本研究获得的西瓜CABYV分离物CABYV-SXJZ(GenBank登录号:OP957280)核苷酸序列与中国南瓜CABYV分离物Inner Mongolia(GenBank登录号:EU262627)的核苷酸序列一致率最高,达到100%;西瓜WVA分离物WVA-SXJZ(GenBank登录号:OP957281)核苷酸序列与同样来自中国瓠瓜WVA分离物WVA-Huizhou(Gen-Bank登录号:MK292710)和西瓜WVA分离物WVA-KF15(GenBank登录号:KY363796)核苷酸序列一致率最高,分别达到93.6%%和99.9%;WCLaV2分离物WCLaV2-SXJZ(GenBank登录号:OP957282)核苷酸序列与WCLaV2巴西西瓜分离物Ju-01(GenBank登录号:LC636075)核苷酸序列一致率最高,达到99.6%;本研究首次从西瓜上获得的CmCV分离物Cm-CV-SXJZ(GenBank登录号:OP957283)核苷酸序列与中国甜瓜分离物CmCV-HLJ(GenBank登录号:MH479773)的核苷酸一致率高达99.9%;本研究获得的CGMMV分离物CGMMV-SXJZ(GenBank登录号:OP957284)核苷酸序列与CGMMV分离物GDLZ(GenBank登录号:MK933286)、CG038(GenBank登录号:MH271443)、CGMMV-pXT1(GenBank登录号:KY753929)、eWT(GenBank登录号:KY753928)、C284R(GenBank登录号:KY753927)、CGMMV-XG(GenBank登录号:KP868654)、JD2(GenBank登录号:KM873785)和Anhui(GenBank登录号:KT236095)核苷酸序列一致率最高,均达到99.8%。

瓜类褪绿黄化病毒新疆分离物基因组分析

2016年秋季,新疆维吾尔自治区吐鲁番市哈密瓜大面积发生叶片黄化和褪绿的病害,症状呈瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)引起的典型特征。通过CCYV的特异性引物对该疑似样本进行了RT-PCR检测,获得了预期大小的扩增片段。随后,对新疆的CCYV分离物(CCYV-Xinjiang)全长基因组进行克隆并测序,获得了CCYV-Xinjiang分离物的RNA1和RNA2全长序列信息。对CCYV-Xinjiang和来自Gen Bank数据库的其他CCYV分离物的基因组序列分析,不同分离物RNA1和RNA2两条链的一致性分别是99.65%~99.93%和99.68%~99.89%。单独对基因组的各个非翻译区(UTRs)和编码区的核苷酸变异分析,数据表明不同区域其变异程度不同,其中RNA2的3'UTR区域变异最大,而RNA1的2个UTRs区域变异最小。对已登录Gen Bank的所有CCYV分离物基因组系统进化树分析结果表明,所有分离物聚在同一个组。另外,对来自Gen Bank的18个分离物的外壳蛋白(CP)氨基酸序列进行系统进化树分析,表明来自伊朗的3个分离物分在组2(GroupⅡ),而来自亚洲其他地区的分离物均被分到组1(GroupⅠ)。基于CCYV基因组的信息,发现来自亚洲地区的CCYV的群体遗传变异很小。

新疆、甘肃和河南部分地区甜瓜瓜类蚜传黄化病毒分子变异初步分析

从新疆鄯善县、甘肃瓜州县和河南通许县采集表现瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)症状的甜瓜叶片样品63份,利用反转录PCR(RT-PCR)检测,从阳性样品中选取25个分离物扩增出1.4 kb的片段,并对其序列进行分析。结果表明:63份样品中,36份为CABYV阳性;获得的序列包括部分3′端的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因、非编码区(NCR)和全长外壳蛋白(CP)基因。随机选取25个分离物的CP基因与GenBank中的序列进行比对,其序列相似性为93.2%~100%。通许分离物间序列相似性为98.8%~99.8%,瓜州分离物间序列相似性为98.2%~100%,鄯善分离物间序列相似性为99.2%~100%,组内表现出极高的同源性。基于其部分RdRp基因、NCR及CP基因序列构建的系统进化树表明:25个CABYV分离物与中国及周边地区(泰国、韩国等)的分离物聚为一簇,而与欧洲地区分离物距离较远,说明了该病毒分子变异与分离物的地理分布有关。