miR-203靶向调控CUL2对HPV16阳性宫颈癌细胞生物学特性的影响

目的探讨微小RNA 203-3p(miR-203)靶向调控枯灵素2(CUL2)对人乳头瘤病毒16型(HPV16)阳性宫颈癌细胞生物学特性的影响。方法收集2018年9月-2019年9月于山西医科大学第二医院妇产科行宫颈癌筛查,HPV检测为单一HPV16阳性,病理检查为宫颈鳞癌(SCC)的样本及相应癌旁组织(对照组)各10份。采用实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SCC与相应癌旁组织,以及人SCC细胞(SiHa)与人永生化表皮细胞(HaCaT)中miR-203的表达。采用GO和KEGG富集法分析miR-203参与的功能和通路,TargetScan网站及双荧光素酶报告基因实验验证miR-203与CUL2的靶向调控作用。将miR-203模拟物或抑制剂转染至SiHa细胞,建立过表达或低表达miR-203的细胞模型,采用qRT-PCR和Western blotting检测CUL2 mRNA及蛋白的表达;采用CCK-8法、划痕实验、AnnexinⅤ-APC/PI双染色法评估SiHa细胞的增殖、迁移和凋亡能力。结果qRTPCR检测分析结果显示,与相应癌旁组织和HaCaT细胞相比,miR-203在SCC组织和SiHa细胞中的表达水平均明显降低(P<0.01)。GO和KEGG富集结果显示,miR-203广泛参与泛素化过程并与恶性肿瘤参与的信号通路有关。TargetScan与双荧光素酶报告基因实验表明,miR-203与CUL2存在靶向调控关系(P<0.01)。qRT-PCR及Western blotting结果表明,过表达miR-203时,CUL2 mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),而低表达miR-203则可上调CUL2 mRNA及蛋白的表达(P<0.01)。CCK-8、划痕实验和AnnexinⅤ-APC/PI双染结果显示,过表达miR-203可降低SiHa细胞的增殖率和迁移率(P<0.01),升高细胞凋亡率(P<0.05);相反,低表达miR-203可升高SiHa细胞的增殖率和迁移率(P<0.01),降低细胞凋亡率(P<0.01)。结论miR-203可能通过靶向CUL2抑制HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa的生物学特性,有望成为宫颈癌诊断和治疗的一个新的候选基因。

microRNA-154-5p靶向枯灵素2对人乳头瘤病毒16阳性子宫颈癌细胞的抑制作用研究

目的探讨microRNA-154-5p(miR-154-5p)靶向枯灵素2(Cullin2,CUL2)对人乳头瘤病毒(HPV)16型阳性子宫颈癌细胞的作用。方法收集山西医科大学第二医院妇产科2018年1月至2020年12月单一HPV16阳性的正常子宫颈(对照组)、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)和子宫颈鳞状细胞癌(CSCC)组织各20份。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学(IHC)分别检测4组子宫颈组织中miR-154-5p和CUL2蛋白的表达情况。双荧光素酶报告分析明确miR-154-5p与CUL2的靶向调控关系。利用慢病毒载体介导的DNA重组技术构建稳定高、低表达miR-154-5p的SiHa细胞,分为miR-154-5p过表达组(Lv-miR-154-5p-OE组)和miR-154-5p沉默组(Lv-miR-154-5p-Sp组),对照组为转染空慢病毒载体的SiHa细胞(LvControl组)。RT-qPCR验证构建效果后,分别采用蛋白免疫印迹(Western blot)、细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)、划痕和Transwell侵袭实验评估差异表达miR-154-5p对CUL2蛋白表达量及SiHa细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果RT-qPCR结果表明,LSIL、HSIL和CSCC 3组中miR-154-5p表达量均低于对照组(11.89±42.31、0.18±0.26、0.03±0.05 vs.288.97±486.64,P<0.05)。IHC结果显示,相较于对照组,LSIL、HSIL和CSCC 3组中CUL2蛋白的表达强度增强。双荧光素酶报告分析证实CUL2为miR-154-5p的下游调控基因。Lv-miR-154-5p-OE组SiHa细胞较Lv-Control组CUL2蛋白表达量少(0.87±0.01 vs.1.00±0.03,P<0.05)、增殖活力低(7.56±0.51 vs.24.80±1.98,P<0.05)、迁移指数小(0.41±0.07 vs.1.00±0.13,P<0.01)、侵袭能力弱(35.33±3.22 vs.66.00±10.15,P<0.01);而Lv-miR-154-5p-Sp组SiHa细胞较Lv-Control组CUL2蛋白表达量多(1.17±0.04 vs.1.00±0.03,P<0.05)、增殖活力高(31.16±0.70 vs.24.80±1.98,P<0.05)、迁移指数大(1.97±0.13 vs.1.00±0.13,P<0.001)、侵袭能力强(134.67±9.29 vs.66.00±10.15,P<0.01)。结论miR-154-5p通过靶向调控CUL2抑制HPV16阳性子宫颈癌细胞的生长,有望成为子宫颈癌治疗的潜在靶点。