家族性高血钾型高血压Cullin3致病突变体neddylation异常的分子机制研究

目的·探讨Cullin3(CUL3)致病突变体Cullin3Δ9(缺失9号外显子,CUL3Δ9)是否由于与COP9信号体(CSN)结合减弱而导致其类泛素化修饰异常。方法·使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养HEK293细胞株,采用脂质体转染技术,将CSN5 siRNA与FLAG-CUL3质粒或FLAG-CUL3Δ9质粒共转染HEK293细胞,Western blotting观察CUL3和CUL3Δ9类泛素化修饰程度的变化;转染FLAG-CUL3或FLAG-CUL3Δ9质粒后,以金属蛋白酶抑制剂1,10-菲咯啉进行预孵育,Western blotting观察CUL3和CUL3Δ9类泛素化修饰程度的变化;在转染FLAG-CUL3质粒和FLAG-CUL3Δ9质粒后,以FLAG抗体与Dynabeads Protein G磁珠行免疫共沉淀,Western blotting观察CUL3或CUL3Δ9与CSN5的结合状态。结果·转染CSN5 siRNA后,CUL3的类泛素化修饰程度增加,而CUL3Δ9的类泛素化修饰程度无明显变化;以1,10-菲罗啉预孵育后,CUL3的类泛素化修饰程度增加,而CUL3Δ9的类泛素化修饰程度无明显变化;免疫共沉淀结果显示CUL3与CSN5结合,而CUL3Δ9与CSN5结合减弱。结论·CUL3Δ9与CSN结合减弱导致类泛素化修饰异常。

慢病毒介导的Cullin3沉默对人胶质瘤细胞的影响

目的:探讨慢病毒介导特异性短发夹RNA(sh RNA)干扰Cullin3表达对人胶质瘤细胞的影响。方法:RT-q PCR及Western blot检测Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中的表达;构建靶向Cullin3的sh RNA重组慢病毒,转染U251和U87MG细胞并测定转染效率。实验分为3组:Blank组(阴性对照组)、NC-sh RNA组(空载慢病毒组)及Cullin3-sh RNA组(慢病毒介导Cullin组)。MTT法和Brd U实验检测细胞活力和增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:与正常人星形胶质细胞相比,Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中高表达。Cullin3-sh RNA转染U251和U87MG细胞后,与Blank组及NC-sh RNA组相比,Cullin3-sh RNA组Cullin3表达水平下降(P<0.05),细胞活力和细胞增殖能力显著降低,侵袭能力下降,细胞周期被阻滞于G0/G1期。结论:Cullin3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示Cullin3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。

微小RNA-455靶向调控泛素连接酶Cullin3活化核转录因子-κB在炎性神经痛中的作用及其机制

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-455靶向调控泛素连接酶Cullin3(CUL3)活化核转录因子-κB(NF-κB)在炎性神经痛中的作用及其机制。方法培养施万细胞(SCs),过表达miR-455、CUL3和反义miR-455以及慢病毒CUL3-短发卡RNA(shRNA)质粒沉默CUL3表达。运用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-455、CUL3和NF-κB的RNA水平表达变化,运用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析CUL3、NF-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β蛋白水平表达变化。组间比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析。结果过表达miR-455组CUL3蛋白表达低于对照组(6.25±1.54比32.56±5.18,F=59.694,P<0.01),而NF-κB(62.75±8.69比12.75±1.59,F=57.505,P<0.01)、TNF-α(186.55±17.84比52.14±6.23,F=66.576,P<0.01)和IL-1β(16.46±4.76比4.86±1.28,F=10.799,P<0.05)蛋白表达高于对照组。反义miR-455组CUL3蛋白表达高于反义miRC组(87.49±8.26比28.16±5.12,t=32.598,P<0.01),而反义miR-455组NF-κB(6.63±0.75比19.22±2.84,t=8.929,P<0.05)、TNF-α(26.23±2.14比63.17±7.76,t=7.739,P<0.05)和IL-1β(2.77±0.56比7.15±1.03,t=11.926,P<0.01)蛋白表达低于反义miRC组。同时,shCUL3组NF-κB(65.28±7.71比12.75±1.59,F=57.505,P<0.01)、TNF-α(172.95±19.57比52.14±6.23,F=66.576,P<0.01)和IL-1β(15.33±3.14比4.86±1.28,F=10.799,P<0.05)的蛋白表达高于对照组。而CUL3过表达组NF-κB(5.27±0.83比16.21±1.58,t=11.937,P<0.01)、TNF-α(19.72±2.04比55.04±4.38,t=14.4,P<0.01)和IL-1β(2.25±0.49比6.79±0.81,t=13.065,P<0.01)蛋白表达低于空转对照组。结论miR-455靶向调控CUL3从而促进了NF-κB蛋白的表达,在炎症性神经痛发病过程中发挥重要作用。

CUL4B、TRPM2在胰腺癌组织中的表达和临床意义

目的探讨胰腺癌组织中E3泛素连接酶Cullin4B(CUL4B)、人瞬时受体电位M2(TRPM2)的表达及临床意义。方法收集2019年3月—2020年3月在西安交通大学医学院附属3201医院接受手术治疗胰腺癌患者86例的癌组织和癌旁组织。采用免疫组织化学检测组织中CUL4B、TRPM2蛋白表达。采用实时荧光定量PCR检测组织中CUL4B、TRPM2 mRNA水平。Spearman秩相关分析CUL4B与TRPM2蛋白表达的关系。Kaplan-Meier曲线分析CUL4B、TRPM2蛋白表达对患者预后的影响。Cox比例风险模型分析胰腺癌预后影响因素。结果胰腺癌组织中CUL4B、TRPM2蛋白阳性率及mRNA基因的相对表达量高于癌旁组织(χ^(2)/t=70.245、60.224、15.741、10.976,P均<0.001)。胰腺癌组织中CUL4B与TRPM2蛋白表达呈显著正相关(r=0.720,P<0.001)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移胰腺癌中CUL4B、TRPM2蛋白阳性率高于Ⅰ~ⅡA期、无淋巴结转移癌组织(χ^(2)=16.511、14.834,15.576、15.007,P均<0.001)。CUL4B阳性组和阴性组3年总生存率分别为9.68%(6/62)、41.67%(10/24),TRPM2阳性组和阴性组3年总生存率分别为8.33%(5/60)、42.31%(11/26),CUL4B阳性组、TRPM2阳性组患者3年累积生存率低于CUL4B阴性组、TRPM2阴性组患者(Log-Rankχ^(2)/P=9.933/0.002、11.102/0.001)。TNM分期ⅡB~Ⅲ期、淋巴结转移、CUL4B阳性、TRPM2阳性是影响胰腺癌不良预后的独立危险因素[HR(95%CI)=1.781(1.199~2.646),1.962(1.172~3.285),2.482(1.445~4.263),1.733(1.223~2.457)]。结论胰腺癌组织中CUL4B、TRPM2表达升高,两者表达与胰腺癌不良临床病理特征有关,是胰腺癌预后相关肿瘤标志物。

CUL3对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制

目的 探讨泛素连接酶Cullin3(CUL3)对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法基于TCGA数据库分析CUL3在胃癌和癌旁组织中的表达及其与临床预后的关系。采用CUL3 shRNA和空载慢病毒转染HGC-27和BGC-823细胞,构建CUL3敲低胃癌细胞系组(shCUL3组)与空载慢病毒转染组(空载组)。采用CCK-8法、克隆形成实验、EdU染色、划痕实验和Transwell实验检测两组的增殖、迁移和侵袭能力;采用Western blotting检测两组上皮-间质转化(EMT)相关蛋白和PI3K/Akt/GSK3β通路蛋白的表达情况;应用PI3K激动剂740 Y-P后检测shCUL3组细胞迁移和侵袭能力的变化。结果 TCGA数据库中CUL3在胃癌中呈高表达,且与胃癌患者预后不良明显相关。CCK-8、克隆形成实验和EdU染色结果显示,与空载组比较,shCUL3组胃癌细胞增殖能力受到抑制(P<0.05),且CUL3 shRNA可明显抑制细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。与空载组比较,shCUL3组E-cadherin蛋白表达升高,波形蛋白、β-catenin、p-PI3K、p-Akt及p-GSK-3β蛋白表达明显降低(P<0.05)。与shCUL3组比较,应用PI3K激动剂740Y-P可部分逆转CUL3shRNA对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。结论 敲低CUL3可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程,CUL3在胃癌中的作用机制可能与激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路相关。

泛素连接酶Cullin3对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制探讨

目的探讨泛素化连接酶E3蛋白(Cullin3,CUL3)对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法基于生物信息学方法获取TNBC组织中CUL3基因和蛋白的表达数据,评估CUL3在TNBC患者肿瘤组织(n=160)中和正常乳腺组织(NC)(n=572)中的表达及其与临床预后的关系。通过CCK8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell实验检测过表达CUL3对TNBC细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响;通过免疫共沉淀(IP)联合质谱分析筛选出可能与CUL3相互作用的蛋白质,确定CUL3调控的底物蛋白为谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1);通过划痕实验、Transwell实验检测过表达GSTP1对TNBC细胞迁移及侵袭能力的影响,探索过表达CUL3是否可以逆转GSTP1对细胞迁移及侵袭能力的影响;通过Western印迹和IP检测CUL3对GSTP1蛋白泛素化修饰的影响,验证CUL3调控GSTP1表达影响TNBC迁移和侵袭的分子机制。结果CUL3在TNBC中表达量显著增高(P<0.0001),CUL3高表达与TNBC患者预后不良相关,高表达CUL3的TNBC患者总生存期(OS)、无病生存期(RFS)均更短(OS,P=0.018;RFS,P=0.008);过表达CUL3可显著增加TNBC细胞增殖(231细胞组F=11.97,P=0.002;468细胞组F=51.92,P<0.001)、迁移[231细胞系和468细胞系过表达组穿膜细胞数分别为(74.7±4.0)、(128.0±6.1)个,而空白对照(NC)组分别为(21.0±2.7)、(70.0±6.6)个,231和468细胞组t分别为-19.24和-11.23,P均<0.001]和侵袭能力(231细胞系和468细胞系过表达组48 h细胞增殖率分别为56.6%±4.4%、51.6%±3.7%,而NC组分别为40.5%±2.9%、32.9%±4.8%,231细胞组t=-5.26,P=0.0063;468细胞组t=-5.38,P=0.0058);GSTP1在TNBC表达中降低,上调GSTP1可抑制TNBC细胞迁移[231细胞系和468细胞系过表达组穿膜细胞数分别为(16.3±6.5)、(33.0±6.2)个,而NC组分别为(34.3±2.5)、(77.3±5.0)个,231细胞组t=5.44,P=0.006;468细胞组t=7.20,P=0.002]和侵袭(231细胞系和468细胞系过表达组48 h细胞增殖率分别为49.6%±1.7%、36.2%±1.4%,而NC组分别为59.4%±4.7%、53.0%±1.7%,231细胞组t=3.42,P=0.027;468细胞组t=13.18,P<0.001),而上调CUL3可逆转GSTP1对细胞迁移[231细胞系和468细胞系过表达组穿膜细胞数分别为(37.0±1.0)、(67.0±5.3)个,231细胞组t=-3.97,P=0.017;468细胞组t=-6.12,P=0.004]、侵袭(231细胞系和468细胞系过表达组48 h细胞增殖率分别为71.9%±3.6%、59.4%±2.1%,231和468细胞组t值分别为-9.61和-16.01,P均<0.001)的抑制作用;CUL3通过增加GSTP1泛素化修饰,促进泛素-蛋白酶体系统降解GSTP1蛋白,从而降低GSTP1蛋白的稳定性。结论过表达CUL3通过促进GSTP1泛素化降解诱导细胞迁移和侵袭,从而促进TNBC发生发展。

果蝇Cullin 3基因dsRNA设计及RNAi效率检测

Cullin 3作为Cullin蛋白家族的一员对调控细胞内蛋白降解有着重要意义。为便于深入研究果蝇中Cullin 3基因的功能,本实验对Cullin 3基因进行dsRNA设计,并通过PCR、体外转录、RNA干扰以及Real-time PCR等方法,检测得到该dsRNA的RNAi效率。实验结果表明:Cullin 3基因的dsRNA具有RNA干扰效果。该实验将为今后研究果蝇Cullin 3基因的功能提供一定的技术支持。

保守类素化相关蛋白同源蛋白3介导拟素化通路在膀胱尿路上皮癌中的表达及其临床意义

目的 检测不同临床分期膀胱尿路上皮癌组织中神经前体细胞表达发育下调的蛋白8(NEDD8)、保守类素化相关蛋白同源蛋白3(DCNL3)和泛素结合酶E2M(UBE2M)的表达水平,并观察DCNL3对骨架蛋白Cullin1和Cullin3拟素化修饰的调控作用,探讨DCNL3介导拟素化通路在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义.方法 选用郑州大学第一附属医院2020年3月至2023年5月行手术切除并经病理证实的膀胱尿路上皮癌标本59例,每例标本均选用癌组织中心及其远端正常黏膜对照.采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学技术检测切除标本中的NEDD8,DCNL3和UBE2M的表达;使用过表达/沉默DCNL3基因及蛋白质印迹法(Western blot)检测膀胱癌细胞株T24中骨架蛋白Cullin1和Cullin3的拟素化水平.组间比较采用两独立样本t检验.患者临床病理特征的分析采用X^(2)检验.结果 DCNL3、UBE2M和NEDD8在膀胱尿路上皮癌组织中的表达明显高于正常黏膜(0.613±0.167比0.985±0.205、1.223±0.558比1.874±0.245、1.639±0.212 比 2.187±0.335,t=1.933、2.142、2.025,P<0.05),差异有统计学意义;其在肌层浸润性尿路上皮癌中的表达高于非肌层浸润性(0.738±0.188比1.245±0.155、1.566±0.385 比 2.532±0.466、1.933±0.485 比 2.748±0.515,t=2.106、2.767、2.367,P<0.05),差异有统计学意义,与临床分期明显相关.高表达DCNL3能够促进底物蛋白Cullin1[(78.55±6.34)%比(35.15±5.32)%,t=26.22,P<0.05]和 Cullin3[(66.82±5.66)%比(22.52±4.66)%,t=22.05,P<0.05]的拟素化水平.结论 DCNL3表达水平与膀胱尿路上皮癌临床分期明显相关,并可能通过调控底物骨架蛋白Cullin1和Cullin3拟素化水平,促进膀胱癌进展.