Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

目的获得高纯度的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。方法以Vif/VR1012质粒为模板,PCR扩增出Vif-ΔN28基因并插入pRSETB质粒。将构建的原核表达载体Vif-ΔN28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性。结果所表达的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上。结论已成功构建了Vif-ΔN28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。

树突状细胞中Rab40b/c相互作用蛋白质的鉴定研究

目的改进串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术,鉴定并验证Rab40b和Rab40c在树突状细胞中的相互作用蛋白质。方法用分子克隆技术构建融合蛋白基因e Xact-6×His-EYFP-Rab40b和e Xact-6×His-EYFP-Rab40c的表达载体,采用慢病毒感染建立融合蛋白e Xact-6×His-EYFP-Rab40b和e Xact-6×His-EYFP-Rab40c稳定表达的树突状细胞系。改进串联亲和纯化技术,通过e Xact-6×His标签进行新型串联亲和纯化和q TOF液质检测,运用Comp PASS算法过滤和GO富集分析,鉴定Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白,并采用免疫共沉淀验证。结果成功构建e Xact-6×His-EYFP-Rab40b和e Xact-6×His-EYFP-Rab40c融合蛋白稳定表达的树突状细胞系。采用新型串联亲和纯化方法,鉴定获得26个Rab40b高可信相互作用蛋白和16个Rab40c高可信相互作用蛋白。Rab40b、Rab40c分别与Elongin B、Elongin C、Cullin5具有相互作用。结论成功建立新型串联亲和纯化方法。Elongin B、Elongin C、Cullin5是Rab40b、Rab40c的相互作用蛋白。

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用。方法:根据GenBank数据库提供的CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl设计原则,设计选择双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),再设计合成为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。结果:经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT-PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达。结论:CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功。