牛蒡子苷元调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究牛蒡子苷元(ARC)通过调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌(OSCC)HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其机制。方法:使用不同质量浓度的ARC处理人HSC-3细胞,CCK-8法检测ARC对细胞增殖活力的影响,以选择适宜的药物浓度。将HSC-3细胞分为对照组、ARC-L组(10 mg/L ARC)、ARC-M组(20 mg/L ARC)、ARC-H组(40 mg/L ARC)和ARC-H+Jagged1/FC组(40 mg/L ARC+1.2μg/mL Jagged1/FC)。采用EdU法检测细胞增殖能力,划痕愈合实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞的迁移、侵袭能力及细胞周期和细胞凋亡率,WB法检测增殖(c-Myc、cyclin D1)、凋亡(BAX、Bcl-2、survivin)、EMT(E-cadherin、vimentin、Snail)及Notch/Hes-1通路(Notch 1、Hes-1、NICD)相关蛋白的表达水平。结果:与0 mg/L相比,10~80 mg/L的ARC均能显著降低HSC-3细胞增殖活力(均P<0.05)。与对照组相比,ARC-L组、ARC-M组和ARC-H组HSC-3细胞EdU阳性率、划痕愈合率、侵袭细胞数、S期和G2/M期细胞占比及c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、survivin、vimentin、Snail、Notch 1、Hes-1和NICD蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率、G0/G1期细胞占比及BAX、E-cadherin的蛋白表达均显著升高(均P<0.05),且呈浓度梯度依赖性。同时使用Notch激动剂Jagged1/FC,则可部分逆转ARC对HSC-3细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及相关蛋白表达的作用(均P<0.05)。结论:ARC可能通过抑制Notch/Hes-1信号通路抑制OSCC细胞HSC-3增殖和侵袭并促进细胞凋亡。

梓醇调节Keap1/Nrf2/HO-1信号通路对口腔鳞癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探究梓醇调节Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1/核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Keap1/Nrf2/HO-1)信号通路对口腔鳞癌细胞恶性生物学行为的影响。方法体外培养口腔鳞癌细胞Tac8113;CCK-8法筛选梓醇最佳作用水平;将Tac8113细胞分为对照组、梓醇组(24μg/mL)、sh-NC组(转染sh-NC慢病毒质粒)、sh-Keap1组(转染sh-Keap1慢病毒质粒)、梓醇+sh-NC组(转染sh-NC+24μg/mL梓醇)、梓醇+sh-Keap1组(转染sh-Keap1+24μg/mL梓醇);CCK-8法检测细胞增殖;划痕试验检测细胞迁移;流式细胞术检测细胞凋亡;2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测细胞活性氧(ROS)水平;采用试剂盒分别检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;Western Blot分别检测Keap1/Nrf2/HO-1信号通路及凋亡相关蛋白表达水平。结果与0μg/mL组比较,随着梓醇剂量增加Tac8113细胞存活率显著降低(P<0.05),因此,选择24μg/mL梓醇作为后续实验的干预条件;与对照组比较,梓醇组Tac8113细胞OD450值、划痕愈合率、ROS水平、MDA水平及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Nrf2、HO-1表达显著降低,细胞凋亡率、SOD水平及Keap1、胱天蛋白酶3(caspase3)表达显著升高(P<0.05);Keap1低表达后Tac8113细胞恶性生物学行为程度加重,且逆转了梓醇对Tac8113细胞恶性生物学行为的影响。结论梓醇抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移,诱导细胞凋亡发挥抑癌作用,可能与上调Keap1表达,下调Nrf2和HO-1表达有关。

姜黄素和Dickkopf-1联用对口腔鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响研究

目的:探讨姜黄素和分泌蛋白DKK1(Dickkopf-1)联用对口腔鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:CCK8实验检测0、5、10、20、40、80μmol/L的姜黄素作用于人口腔鳞状细胞癌CAL27、Tca8113、SCC-4细胞24、48、72h的细胞增殖情况,计算IC50值;实验分为对照组、姜黄素组、Dickkopf-1组、姜黄素+Dickkopf-1组,各组细胞处理48h后,CCK8试验检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测Cleaved caspase3、β-catenin、CyclinD1蛋白表达。结果:不同浓度的姜黄素作用于CAL27、SCC-4、Tca8113细胞24、48、72h后的细胞抑制率均显著高于0h时的细胞抑制率,且随着时间延长及浓度增加细胞抑制率增加(P<0.01),根据IC50值选择Tca8113细胞及30μmol/L的姜黄素作为后续研究。结论:姜黄素和Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Dickkopf-1均能抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和促进凋亡,两者联用的效果强于单独用姜黄素或Dickkopf-1。

miR-498靶向磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1对口腔鳞状细胞癌细胞生长的影响

目的探讨miR⁃498靶向磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(PCK1)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞生长的影响。方法qRT⁃PCR检测150例OSCC患者肿瘤组织及OSCC细胞系HSC⁃3、SCC⁃15、SCC⁃9中miR⁃498表达;将miR⁃498 mimics和anti⁃miR⁃498分别转染于SCC⁃15细胞,qRT⁃PCR检测细胞中miR⁃498水平,western blot检测细胞中PCK1蛋白表达,CCK⁃8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移与侵袭;双荧光素酶报告基因检测miR⁃498与PCK1的靶向关系;共转染miR⁃498和PCK1进一步验证miR⁃498和PCK1对SCC⁃15细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。结果与人正常口腔角质细胞HOK(1.03±0.14)比较,人OSCC细胞系HSC⁃3(2.05±0.21)、SCC⁃15(2.75±0.31)、SCC⁃9(2.31±0.28)中miR⁃498的表达水平显著升高(F=53.639,P<0.001),且SCC⁃15细胞中miR⁃498的表达量最高,因此,选择SCC⁃15细胞进行后续研究。与对照组和miR⁃NC组比较,miR⁃498 mimics组SCC⁃15细胞迁移与侵袭数目显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与对照组和anti⁃miR⁃NC组比较,anti⁃miR⁃498组SCC⁃15细胞迁移与侵袭数目显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。miR⁃498 mimics组(0.23±0.02)SCC⁃15细胞中PCK1蛋白表达水平显著低于对照组(0.51±0.08)和miR⁃NC组(0.49±0.06,P<0.05);anti⁃miR⁃498组(1.03±0.05)SCC⁃15细胞中PCK1蛋白表达水平显著高于对照组(0.51±0.08)和anti⁃miR⁃NC组(0.48±0.07,P<0.05)。miR⁃498靶向负调控PCK1表达,上调PCK1表达可逆转过表达miR⁃498对SCC⁃15细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结论miR⁃498通过靶向抑制PCK1表达促进SCC⁃15细胞增殖、迁移、侵袭,抑制细胞凋亡,可能为OSCC的临床诊治提供新的分子靶标。

miR-486-3p靶向DDR1对口腔鳞状细胞癌的抑制作用及槟榔致口腔鳞状细胞癌的可能机制

目的探讨miR-486-3p靶向盘蛋白结构域受体1(DDR1)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)的抑制作用,并基于miR-486-3p和DDR1分析槟榔致OSCC的可能机制。方法(1)收集20例原发性OSCC患者肿瘤组织及癌旁组织以检测miR-486-3p的表达水平。(2)取人口腔表皮癌(OEC)-M1细胞,分为对照1组(常规培养细胞,不给予任何特殊处理)、miR-486-3p mimic组(转染miR-486-3p mimic)、miR-486-3p inhibitor组(转染miR-486-3p inhibitor),以及对照2组(常规培养细胞,不给予任何特殊处理)、OE-DDR1组(转染过表达DDR1的慢病毒质粒)、sh-DDR1组(转染低表达DDR1的慢病毒质粒)。检测各组细胞增殖能力,以及活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、Caspase-3蛋白表达水平。检测对照1组、miR-486-3p mimic组、miR-486-3p inhibitor组DDR1 mRNA的表达水平。(3)取HEK293细胞,分别转染miR-486-3p mimic和野生型或突变型DDR13端非翻译区。通过TargetScan数据库及双荧光素酶实验分析miR-486-3p与DDR1的结合情况。(4)取OKF4/TERT-1细胞,分为无槟榔碱组(不给予槟榔碱处理)和槟榔碱组(用槟榔碱连续刺激5 d),检测两组细胞miR-486-3p、DDR1 mRNA及蛋白表达水平。结果(1)与癌旁组织相比,OSCC组织中miR-486-3p表达水平降低(P<0.05)。(2)与对照1组/对照2组相比,miR-486-3p mimic组/sh-DDR1组OEC-M1细胞增殖能力降低,cleaved Caspase-3表达水平升高,而miR-486-3p inhibitor组/OE-DDR1组OEC-M1细胞增殖能力增高,cleaved Caspase-3表达水平降低(均P<0.05)。与对照1组相比,miR-486-3p mimic组OEC-M1细胞的DDR1 mRNA表达水平降低,miR-486-3p inhibitor组DDR1 mRNA表达水平升高(均P<0.05)。(3)miR-486-3p与野生型DDR1存在结合位点。(4)与无槟榔碱组相比,槟榔碱组OKF4/TERT-1细胞中miR-486-3p表达水平降低,DDR1 mRNA和蛋白表达水平升高(均P<0.05)。结论miR-486-3p通过靶向下调DDR1的表达,抑制OSCC细胞增殖,促进OSCC细胞凋亡,进而发挥抑癌作用。槟榔可能通过调控miR-486-3p和DDR1的表达从而诱发OSCC。

circ_0005379通过调控miR-17-5p/酰基辅酶A氧化酶1轴抑制口腔鳞状细胞癌的发展进程

目的探讨circ_0005379对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法分别以癌旁正常组织及正常口腔黏膜细胞HOK-16A为对照,实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测OSCC组织和SCC15细胞中circ_0005379和miR-17-5p表达水平,蛋白印迹(Westernblot)检测酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)蛋白表达水平。转染circ_0005379过表达载体至SCC15细胞,四甲基噻唑蓝(MTT)染色法、流式细胞术、Transwell和Westernblot分别检测过表达circ_0005379对SCC15细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭及上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)、β连环素(β-catenin)和Snail蛋白表达的影响。双荧光素酶报告基因实验检验SCC15细胞中circ_0005379与miR-17-5p及miR-17-5p与ACOX1调控关系。建立稳定过表达circ_0005379的SCC15细胞裸鼠移植瘤模型,观察过表达circ_0005379对裸鼠移植瘤生长的影响。结果与癌旁组织比较,OSCC组织中circ_0005379和ACOX1蛋白表达降低(P<0.05),miR-17-5p表达升高(P<0.05)。与HOK-16A细胞比较,SCC15细胞中circ_0005379和ACOX1蛋白表达降低(P<0.05),miR-17-5p表达升高(P<0.05)。过表达circ_0005379后,SCC15细胞活性、迁移和侵袭细胞数及β-catenin和Snail蛋白表达降低(P<0.05),凋亡率和E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。circ_0005379靶向负调控miR-17-5p表达,ACOX1是miR-17-5p的靶基因。过表达miR-17-5p可逆转过表达circ_0005379对OSCC细胞系增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。过表达circ_0005379的裸鼠肿瘤体积和重量降低(P<0.05),肿瘤组织中circ_0005379和ACOX1蛋白表达水平升高(P<0.05),miR-17-5p表达水平降低(P<0.05)。结论circ_0005379可能通过靶向miR-17-5p/ACOX1来抑制体外OSCC细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡,同时抑制体内肿瘤生长,其可能是OSCC治疗的潜在靶点。

MALAT-1沉默对口腔鳞癌细胞增殖、凋亡及Caspase-3通路的影响

目的探究RNA干扰技术(RNAi)沉默肺癌转移相关转录本-1(MALAT-1)基因对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖、凋亡的影响并探讨其作用机制。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MALAT-1在人正常口腔上皮细胞系HIOE和OSCC细胞系SCC25中的表达情况。实验分为四组:空白对照组不转染序列;阴性对照组采用对照序列进行转染;RNAi组采用MALAT-1SiRNA进行转染;inhibitor组在SiRNA转染SCC25细胞前30 min,向培养基中加入Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO进行预处理(终浓度为40μmol/L)。采用RNAi技术敲低SCC25细胞中MALAT-1表达,采用透射电子显微镜(TEM)观察SCC25细胞超微结构;采用CKK-8法检测细胞增殖情况;采用流式膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)法检测细胞凋亡情况;采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测Caspase-3 mRNA和蛋白表达情况。结果与正常细胞比较,MALAT-1在人OSCC细胞系SCC25中表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。转染MALAT-1 SiRNA可明显降低SCC25细胞中MALAT-1表达(P<0.05)。与阴性对照组和空白对照组比较,RNAi组SCC25细胞增殖抑制率明显升高,细胞凋亡明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05);细胞呈现出典型的凋亡特征;细胞中Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05)。加入Caspase-3抑制剂预处理,细胞凋亡明显减弱(P<0.05)。结论 MALAT-1沉默抑制人OSCC细胞系SCC25细胞增殖,促进凋亡,推测可能通过Caspase-3凋亡通路发挥作用。

姜黄素对口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨姜黄素对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)Tca8113细胞增殖及凋亡的影响,并研究其作用机制。方法体外培养Tca8113细胞,不同浓度姜黄素(0、25、50、100μmol/L)处理24、48h;PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002、激动剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)姜黄素、IGF-1联合姜黄素处理24、48h。分别采用MTT法和流失细胞术检测细胞增殖和凋亡情况;采用Western blot和RT-PCR法检测细胞PI3K、p-AKT及mTOR的蛋白及mRNA表达水平。结果姜黄素可显著抑制OSCC Tca8113细胞的增殖并诱导凋亡,且具有一定的剂量和时间依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);同时,姜黄素下调Tca8113细胞中的PI3K、p-AKT及mTOR的蛋白及mRNA表达水平(P<0.05)。IGF-1处理促进了Tca8113细胞的增殖、降低了凋亡率,同时增加PI3K、p-AKT及mTOR的蛋白及mRNA表达水平,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);与IGF-1组相比,IGF-1联合姜黄素组可降低细胞的活性、提高细胞的凋亡率,降低PI3K、p-AKT及mTOR的蛋白及mRNA表达水平(P<0.05)。结论姜黄素可抑制OSCC Tca8113细胞的增殖、诱导细胞凋亡,其作用机制可能与其抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达有关。

补骨脂酚对口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和凋亡的影响及其机制

目的探究SIRT1是否介导补骨脂酚对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)增殖、迁移及凋亡的影响。方法将体外培养的OSCC细胞系分为4组:正常(control)组,补骨脂酚处理(BAK)组,补骨脂酚处理+SIRT1抑制剂(BAK+EX527)组,SIRT1抑制剂(EX527)组。CCK-8法检测EX527和不同剂量BAK(1,2,5,10μmol/L)对OSCC细胞活力的影响,TUNEL染色检测OSCC细胞凋亡率,Western blot检测蛋白SIRT1、Ac-FOXO1、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达水平,划痕实验检测OSCC细胞迁移能力。结果与control组相比,补骨脂酚呈剂量依赖性地抑制OSCC细胞的细胞活力,而补骨脂酚剂量为5μmol/L时效果最佳,因此采用该剂量进行下一步机制研究。与control组相比,BAK组SIRT1、Bax和Caspase 3的表达量、OSCC细胞凋亡率和划痕实验细胞间距明显增加,而Ac-FOXO1、Bcl-2的表达量明显减少。EX527阻断SIRT1信号通路可明显减弱BAK的上述作用(均P<0.05)。结论补骨脂酚可通过激活SIRT1信号通路,促进OSCC细胞凋亡,抑制OSCC细胞增殖和迁移。

甘草素抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖的机制研究

目的研究甘草素通过微RNA-486-3p(microRNA-486-3p,miR-486-3p)靶向盘蛋白结构域受体-1(discoidin domain receptor 1,DDR1)抑制口腔鳞状细胞癌及其作用机制。方法采用不同浓度甘草素处理人口腔鳞状细胞癌SCC-15细胞48 h,MTT法检测甘草素对细胞生存率的影响。将细胞分为对照组、甘草素组、miR抑制剂组、病毒对照组、抑制慢病毒组和过表达慢病毒组,RT-PCR检测miR-486-3p和DDR1表达;5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)染色检测细胞增殖情况;Western blot检测cleaved Caspase-3和Caspase-3表达。将细胞分为转染对照组和转染组,使用包含野生型或突变型DDR13'-UTR的双荧光素酶报告基因检测系统检测miR-486-3p和DDR1的结合情况。结果与0μmol/L甘草素比较,100、120、150μmol/L甘草素能明显抑制SCC-15细胞的生存率(P<0.05)。与对照组比较,甘草素组miR-486-3p的相对表达量、cleaved Caspase-3/Caspase-3相对比率均明显升高(P<0.05),DDR1的相对表达量、EdU阳性细胞相对比值均明显降低(P<0.05)。与甘草素组比较,miR抑制剂组miR-486-3p的相对表达量、cleaved Caspase-3/Caspase-3相对比率均明显降低(P<0.05),DDR1的相对表达量、EdU阳性细胞相对比值均明显升高(P<0.05)。与病毒对照组比较,抑制慢病毒组EdU阳性细胞相对比率明显降低(P<0.05),cleaved Caspase-3/Caspase-3相对比率明显升高(P<0.05);过表达慢病毒组EdU阳性细胞相对比率明显升高(P<0.05),cleaved Caspase-3/Caspase-3相对比率明显降低(P<0.05)。miR-486-3p与DDR1存在结合位点。与转染对照组比较,转染组相对荧光素酶活力明显降低(P<0.05),野生型DDR13'-UTR相对荧光素酶活力明显降低(P<0.05)。结论甘草素通过miR-486-3p靶向DDR1抑制SCC-15细胞增殖,促进细胞凋亡,进而发挥抗肿瘤作用。

青蒿琥酯抑制Twist 1蛋白表达和血管再生以及降低口腔鳞癌细胞Tca8113转移的作用

目的研究青蒿琥酯抑制Twist 1表达、降低口腔鳞癌细胞的转移及对血管生成的抑制作用。方法采用50、100、150、200μg·m L^(-1)的青蒿琥酯体外培养的口腔鳞癌细胞,然后分别采用Western blot法、MTT法、划痕实验及流式细胞仪检测不同浓度的青蒿琥酯干预对口腔鳞癌细胞Twist1表达、增殖、迁移及凋亡的影响;采用鸡胚尿囊膜检测青蒿琥酯对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。结果与对照组对比,青蒿琥酯可抑制Twist1蛋白的表达、口腔鳞癌细胞的增殖和迁移,且存在时间和剂量依赖性;青蒿琥酯可引起细胞的凋亡,处理组的细胞凋亡率显著高于对照组;青蒿琥酯对鸡胚尿囊膜血管新生有一定的抑制作用(P<0.05)。结论中药青蒿琥酯可抑制Twist 1蛋白的表达、细胞增殖、迁移,同时可有效抑制血管再生。

XAF1在口腔鳞癌中的表达及对CAL27细胞生长和凋亡的影响

目的:研究X-染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-chromosome-linked inhibitior of apoptosis protein,XIAP)相关因子1(XIAP associated factor 1,XAF1)在口腔鳞癌组织中的表达及临床意义,进一步观察过表达XAF1对口腔鳞癌CAL27细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响。方法:应用免疫组织化学方法检测64例口腔鳞癌及14例正常口腔黏膜组织标本中XAF1蛋白的表达,分析XAF1表达水平与患者临床病理特征的相关性。CAL27细胞转染XAF1表达质粒,Real-time PCR检测转染24 h时XAF1 m RNA的表达;倒置显微镜观察细胞形态变化;CCK8和平板克隆实验检测过表达XAF1对细胞生长的影响;流式细胞仪和Western Blot检测细胞凋亡的影响。结果:XAF1蛋白在口腔鳞癌组织表达较正常口腔黏膜上皮组织降低。XAF1的表达与患者的TNM分期相关。过表达XAF1抑制口腔鳞状细胞癌CAL27细胞的增殖和克隆形成,凋亡细胞百分比和cleaved-PARP表达增加。结论:XAF1在口腔鳞癌组织中表达降低,可能与口腔鳞癌的进展相关。过表达XAF1抑制口腔鳞状细胞癌细胞的生长,促进细胞凋亡。