缝隙连接蛋白Cx36在左旋多巴诱发异动症大鼠发病机制中的作用

目的:研究纹状体区缝隙连接蛋白36(Cx36)在左旋多巴诱发的异动症(LID)形成机制中的作用。方法:60只SD大鼠按照随机数字表分成正常组、假手术组、帕金森病(PD)组、观察组和雷帕霉素对照组,每组12只。向右侧内侧前脑束注射6-羟多巴(6-OHDA)建立偏侧PD大鼠模型,以左旋多巴治疗PD大鼠,制作LID大鼠模型,观察组造模后给予左旋多巴连续治疗3周,雷帕霉素对照组造模后在左旋多巴治疗的同时,给与雷帕霉素干预。正常组、假手术组、PD组不做任何治疗或只给与安慰剂。采用不自主运动(AIM)评分评估观察组和雷帕霉素对照组大鼠不自主运动的行为学改变,运用免疫组化技术检测5组大鼠纹状体区右侧Cx36表达,探讨Cx36表达水平与行为学的关系。结果:观察组大鼠的AIM评分明显高于雷帕霉素对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组损毁侧纹状体区Cx36表达明显高于其余4组(P<0.01);Cx36表达和AIM评分成正相关。结论:Cx36的表达水平的增高与LID的形成关系密切。Cx36的表达上调可能强化了纹状体神经元同步化振荡放电,加剧纹状体区多巴胺能神经元内直接通路和间接通路的失衡,促成纹状体异常信号的输出,最终导致LID的形成。

间隙连接蛋白家族新成员Cx36

Cx36是哺乳动物间隙连接蛋白(connexin,Cx)家族γ亚类的第一个成员,它参与形成间隙连接,介导相邻细胞间的物质和信息的直接交换。间隙连接是神经系统构成电突触的结构基础,参与调控神经冲动信息的传递和复杂神经网络的整合,而Cx36是唯一一个在神经系统中优先表达的Cx,因此成为电生理研究领域的热点。就Cx36的发现过程、结构和定位进行了总结,并着重介绍它在神经系统中的功能和调节机制。

Cx36在癫持续状态大鼠海马神经元的表达

目的观察连接蛋白36(Cx36)在癫持续状态大鼠海马神经元的表达。方法建立36只氯化锂-匹罗卡品诱导的癫持续状态大鼠模型,随机分为生理盐水组、喹啉组、辛醇组(每组12只),分别予以腹腔注射生理盐水、喹啉、辛醇,通过Racine评分判断大鼠给药前后癫发作情况,利用免疫荧光染色法、Western-blot法检测各组大鼠海马Cx36的表达。结果喹啉组和辛醇组给药前后大鼠行为学评分比较差异有统计学意义(P<0.01);而生理盐水组差异无统计学意义(P>0.05)。喹啉组和辛醇组大鼠海马神经元Cx36的表达明显低于生理盐水组(P<0.01),但2组Cx36的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Cx36在癫发作中起着重要作用,可能成为潜在的治疗靶点。

全长和截短型Cx36基因重组载体的构建及在Hela细胞的表达

目的V构建全长及截短型Cx36基因重组表达载体,观察其在Hela细胞的表达。方法RTPCR获得全长及截短型Cx36编码区基因片段,与pCR2.1TOPO克隆载体连接酶切纯化鉴定,亚克隆到pcDNA3构建真核表达载体,脂质体介导法转染Hela细胞,G418抗性筛选阳性克隆,Western印迹和免疫荧光方法分析Hela细胞Cx36的表达。结果构建了全长及截短型重组真核表达载体Cx36-pcDNA3,转染的Hela细胞获得稳定表达Cx36的基因,Western印迹和免疫荧光显示转染的HeLa细胞表达Cx36蛋白,但转染截短型Cx36的Hela细胞表达量明显少于转染全长Cx36的细胞。结论全长及截短型Cx36基因可在Hela细胞中稳定表达,截短型Cx36基因表达较少。

热性惊厥大鼠海马组织和皮质神经元中连接蛋白Cx36的表达及意义

目的探讨缝隙连接蛋白Cx36在热性惊厥大鼠海马组织和皮质神经元中的表达。方法将大鼠按随机数字表法分为2组：正常对照组与实验组。实验组根据热水浴法建立惊厥大鼠模型，按大鼠是否惊厥再分为高热对照组和热性惊厥组，采用Westernblot和免疫荧光方法分析正常对照组、高热对照组和热性惊厥组大鼠海马组织和皮质神经元Cx36蛋白表达，多组样本均数比较采用单因素方差分析，均数的两两比较采用LSD法，方差不齐者采用Tamhane’s检验。结果热水浴诱导大鼠惊厥的潜伏期、惊厥持续时间及惊厥时的体温分别为（4．39±0．08）min、（5．38±0．07）min和（41．87±0．06）℃。Westernblot结果表明，热性惊厥组惊厥发作10次后，正常对照组、高热对照组和热性惊厥组3组比较，Cx36蛋白在海马区及皮质区表达呈逐渐降低趋势，热性惊厥组降低程度最明显。诱导惊厥发作1次、5次和10次后，与正常对照组和高热对照组比较，热性惊厥组皮质和海马神经元Cx36蛋白表达均明显降低，且随惊厥次数增加，皮质（0．104±0．012）和CAl（0．091±0．011）、CA3（0．090±0．011）和DG区（0．092±0．012）海马神经元Cx36蛋白表达较正常对照组（0．212±0．017、0．167±0．013、0．159±0．014、0．171±0．013）和高热对照组（0．189±0．006、0．144±0．008、0．129±0．005、0．165±O．011）明显降低，差异均有统计学意义（P均〈0．05）。此外，Cx36表达降低程度与惊厥次数有关。结论随热性惊厥发作次数增加，大鼠海马和皮质神经元中Cx36表达明显下降，可能导致惊厥阈值降低，更易于反复发作。

卒中后抑郁大鼠认知功能障碍与Cx36表达的相关性研究

目的探讨卒中后抑郁(PSD)大鼠海马缝隙连接蛋白Cx36与认知功能障碍的相关性,探寻PSD认知功能障碍的潜在发病机制。方法将42只大鼠随机分为正常组、卒中组、抑郁组、PSD组、生理盐水组、甘珀酸(CBX)组和全反式维甲酸(ATRA)组,每组6只。抑郁组每天随机给予1种慢性不可预测的温和性刺激并孤养;向卒中组大鼠的运动皮层注射内皮素-1制备局灶性缺血型大鼠模型,PSD组、生理盐水组、CBX组和ATRA组在卒中组的基础上叠加抑郁刺激建立PSD模型。在PSD造模的同时,PSD组不进行干预;生理盐水组每天腹腔注射生理盐水1 ml;ATRA组每天腹腔注射浓度为1 mg/ml的1 ml乙醇和磷酸盐缓冲液(按1∶9配置);CBX组按照20 mg/kg的标准每天腹腔注射CBX。于卒中术后28 d,采用糖水实验、水迷宫实验、穿梭实验检测大鼠的兴趣缺失感、空间记忆能力、学习记忆能力,验证PSD认知障碍模型是否诱导成功;采用Real-time PCR检测大鼠海马Cx36 mRNA表达变化;采用Western blotting检测和免疫荧光检测大鼠海马Cx36蛋白的表达量和平均荧光强度。结果术后28 d,PSD组大鼠体重[(257.05±4.74)g]低于正常组[(352.00±7.99)g]、卒中组[(303.95±4.63)g],差异有统计学意义(P<0.05);PSD组大鼠24 h糖水饮用率[(61.92±3.12)%]低于正常组[(83.40±5.38)%]、卒中组[(88.03±3.65)%]、ATRA组[(71.15±4.55)%],高于CBX组[(49.62±5.85)%],差异有统计学意义(P<0.05);PSD组大鼠水迷宫潜伏时间[(51.18±4.14)s]长于正常组[(9.05±2.22)s]、卒中组[(9.06±2.25)s]、ATRA组[(32.92±2.29)s],短于CBX组[(91.13±3.27)s],差异有统计学意义(P<0.05);PSD组穿梭实验主动逃避次数[(10.67±1.51)次]少于正常组[(18.00±2.10)次]、卒中组[(16.5±1.87)次]和ATRA组[(13.83±1.17)次],多于CBX组[(7.00±1.26)次],差异有统计学意义(P<0.05)。术后28 d,PSD组海马区Cx36 mRNA表达量(0.50±0.03)低于正常组(1.04±0.07)、卒中组(1.07±0.10)和ATRA组(0.76±0.11),高于CBX组(0.20±0.06),差异有统计学意义(P<0.05);PSD组海马区Cx36蛋白相对表达量(0.60±0.07)低于正常组(0.86±0.05)、卒中组(0.88±0.03)和ATRA组(0.77±0.07),高于CBX组(0.56±0.02),差异有统计学意义(P<0.05);PSD组海马区Cx36蛋白平均荧光强度(0.36±0.03)低于正常组(1.00±0.03)、卒中组(0.97±0.03)和ATRA组(0.50±0.02),高于CBX组(0.21±0.03),差异有统计学意义(P<0.05)。结论PSD大鼠海马Cx36蛋白水平降低,CBX干预能降低Cx36蛋白表达并且大鼠认知功能障碍加重,ATRA干预能增加Cx36蛋白的表达并且大鼠认知功能障碍稍有好转。

银杏叶提取物预处理对大鼠术后认知功能的影响

目的探讨银杏叶提取物预处理对大鼠术后认知功能的影响及可能机制。方法雄性无特定病原体（SPF）级SD大鼠54只,体重600~700g,月龄12月左右,按随机数字表法分为三组：空白对照组（C组）、手术组（O组）和Egb干预＋手术组（E组）,每组18只。E组于手术前连续5d腹腔注射Egb 100mg/kg,C组和O组分别腹腔注射等量生理盐水。行肝叶部分切除术建立大鼠术后认知功能障碍（POCD）模型。采用Morris水迷宫测试观察各组大鼠认知功能变化。三组大鼠于术前5d行定位航行实验训练,记录大鼠逃避潜伏期。于术后第3、5、7天行空间探索实验测试,记录目标象限停留时间和穿台次数。应用透射电镜观察大鼠海马CA1区缝隙连接结构,Western blot法测定大鼠海马缝隙连接蛋白Cx36的表达水平。结果大鼠术前定位航行实验第1天到第5天各组逃避潜伏期均逐渐缩短,但三组差异无统计学意义。术后第3、5、7天E组和O组大鼠目标象限停留时间明显短于C组（P〈0.05）,穿台次数明显少于C组（P〈0.05）;E组大鼠目标象限停留时间明显长于O组（P〈0.05）,穿台次数明显多于O组（P〈0.05）。C组大鼠海马CA1区神经元之间的缝隙连接部分正常;O组大鼠术后3、5、7天海马CA1区神经元之间缝隙连接细胞膜结构不连续,通道间距不规则增宽,中间有空泡状结构。E组海马CA1区神经元之间细胞膜密度较高,至第7天基本恢复正常,与C组相似。术后第3、5、7天O组大鼠海马Cx36蛋白的表达水平明显低于C组（P〈0.05）,E组大鼠海马Cx36蛋白的表达水平明显高于O组（P〈0.05）。术后第3、5天E组大鼠海马Cx36蛋白的表达水平明显低于C组（P〈0.05）;术后第7天E组大鼠海马Cx36蛋白的表达水平低于C组,但差异无统计学意义。结论银杏叶提取物预处理可改善大鼠术后的认知功能,其机制可能与影响海马缝隙连接结构及Cx36蛋白的表达有关。

抑制NADPH氧化酶对脑缺血/再灌注损伤的保护作用

目的研究抑制NADPH氧化酶对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法利用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,于缺血前15 min尾静脉注射apocynin 2.5 mg·kg-1,脑缺血2 h恢复血液再灌注24 h后,对大鼠进行神经行为学评分、脑梗死体积、脑组织病理形态学以及Cx36、PKC、Bax、Bcl-2蛋白表达变化的检测。结果使用NADPH氧化酶抑制剂apocynin,能明显降低局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠神经行为学评分和脑梗死体积百分率,减轻脑组织病理形态学损伤,增加大鼠Cx36、PKC蛋白的表达,降低Bax与Bcl-2的比值。在使用apocynin的基础上加用PKC激酶抑制剂,与单用apocynin组相比,其上述保护作用则减弱。结论抑制NADPH氧化酶能够减轻脑缺血/再灌注损伤,并且能增高Cx36、PKC的蛋白表达,降低Bax与Bcl-2的比值。

连接蛋白36和闭锁小带蛋白1在HeLa细胞的表达及相互关系研究

目的观察连接蛋白36和闭锁小带蛋白1在HeLa细胞的表达及探讨两者之间的相互关系。方法RT-PCR获得Cx36全长编码区基因片段,与PCR2.1TOPO克隆载体连接测序,亚克隆到pcDNA3真核表达载体,脂质体介导法转染HeLa细胞,G418抗性筛选阳性克隆,Western blotting,双标记免疫荧光和免疫沉淀分析HeLa细胞Cx36和ZO-1表达及关系。结果构建了重组真核表达载体Cx36-pcDNA3,转染的HeLa细胞获得稳定表达Cx36的克隆,Western blotting显示转染的HeLa细胞表达Cx36蛋白。双标记免疫荧光染色显示,HeLa细胞膜之间Cx36呈点状或线状表达,在Cx36表达部位也同样表达ZO-1。免疫沉淀显示细胞裂解液分别与抗ZO-1或抗Cx36抗体共沉淀,抗Cx36或抗ZO-1抗体进行免疫检测,前者在36kD有特异性Cx36蛋白带,后者在220kD处有ZO-1蛋白带。结论转染Cx36的HeLa细胞表达Cx36和ZO-1,两者共表达并且相互结合。

缝隙连接蛋白及其阻断剂研究进展

缝隙连接是细胞间的主要连接方式,广泛分布于心肌细胞及神经细胞等。细胞间电活动的传递主要是通过缝隙连接来完成,丰富的、通道阻抗小的缝隙连接构成了细胞间电偶联的基础。缝隙连接蛋白Cx43是构成心室缝隙连接通道的结构基础,与心房颤动、风湿性心瓣膜病等心脏疾病密切相关。缝隙连接蛋白Cx36介导的缝隙连接通路在癫痫、神经元损伤等神经系统疾病中扮演着重要角色。在中枢神经系统中,缝隙连接蛋白Cx36是唯一在神经元特异性表达的缝隙连接蛋白,尤其在海马的CA1、CA3、CA4等区高度表达,Cx36可能在癫痫电活动方面发挥重要作用。缝隙连接蛋白介导通道的通透功能具有较高的可塑性,可以被很多因素调控。应用缝隙连接阻断剂可减轻缝隙连接相关疾病的症状,在心脏、神经系统疾病新药研发中具有重要作用。因此,缝隙连接阻断剂有可能成为相关疾病治疗的研究热点。本文就心肌细胞及神经细胞缝隙连接蛋白的典型代表Cx43、Cx36及其阻断剂的研究进展进行综述。

缝隙连接蛋白在老年大鼠认知功能障碍中作用

目的:探讨老年大鼠认知功能障碍和海马神经元电突触缝隙连接蛋白CX36之间的关系。方法:SD老年雄性大鼠40只,随机分为4组(n=10)。对照组(C组):灌胃2ml生理盐水21d后行腹腔注射生理盐水2ml,连续3d;氯胺酮组(K组):灌胃2ml生理盐水21d后行腹腔注射氯胺酮80mg/(kg.d),连续3d;盐酸多奈哌齐1组(D1组):灌胃盐酸多奈哌齐1mg/(kg.d)持续21d后行腹腔注射氯胺酮80mg/(kg.d),连续3d;盐酸多奈哌齐2组(D2组):灌胃盐酸多奈哌齐3mg/(kg.d)持续21d后行腹腔注射氯胺酮80mg/(kg.d),连续3d。停药1d后进行Morris水迷宫行为学测试。测试完毕后立即处死大鼠,制备海马脑片进行免疫组织化学染色,测定海马CX36蛋白的表达;RT-PCR方法检测CX36mRNA表达;ELISA测定各组海马乙酰胆碱浓度。结果:①水迷宫测试结果K组第2,3天的潜伏期和游泳距离均明显长于C组(P<0.05),盐酸多奈哌齐组(D1,D2组)第3天的潜伏期和游泳距离明显缩短于K组(P<0.05),D1与D2之间差异无统计学意义。②CX36蛋白的表达K组大鼠海马CX36蛋白表达显著减少,与C组、D1组和D2组比较差异有统计学意义(P<0.05),而D1组、D2组与C组比较差异无统计学意义,D1组与D2组比较差异也无统计学意义。③各组海马CX36 mRNA的差异无统计学意义。④海马乙酰胆碱浓度与C、K组比较,D1、D2组大鼠乙酰胆碱浓度明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:缝隙连接蛋白CX36在老年大鼠认知功能障碍中起重要作用,其功能可能主要通过快速调节发挥作用。

针刺“长强”穴对自闭症模型大鼠学习记忆能力和前额叶皮层缝隙连接相关蛋白表达的影响

目的:观察针刺"长强"穴对自闭症模型大鼠学习和记忆能力及对前额叶皮层缝隙连接相关蛋白(CX)表达的影响,探讨针刺"长强"穴改善自闭症大鼠学习记忆能力的可能机制。方法:Wistar孕鼠予以腹腔注射丙戊酸钠后所产子代,经睁眼试验、游泳试验筛选后,确定为自闭症大鼠模型,随机挑选30只,分为长强组、非穴组、模型组,每组10只,正常Wistar大鼠子代随机挑选10只作为空白组。长强组针刺"长强",每次1min,10d为1个疗程,干预3个疗程;非穴组取胁下非经非穴点针刺。采用Morris水迷宫观察大鼠学习记忆能力,免疫组化法检测大鼠前额叶皮层CX 43、CX 32、CX 36蛋白的表达。结果:自闭症模型组幼鼠睁眼时间在出生后14d(PN 14)、PN 15、PN 16较空白组晚(P<0.05),游泳能力在PN 13和PN 15时较空白组低下(P<0.05)。治疗前长强组、非穴组、模型组逃避潜伏期及平均速度与空白组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后长强组较模型组及非穴组明显改善(P<0.05)。与空白组比较,模型组CX 43、CX32、CX 36蛋白的表达显著降低(P<0.05);治疗后,长强组CX 43、CX 32、CX 36蛋白的表达显著高于模型组和非穴组(P<0.05)。结论:针刺"长强"穴能通过提高前额叶皮层CX 43、CX 32、CX 36蛋白的表达来改善自闭症模型大鼠学习和记忆能力。