双峰驼Cyp-A的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备双峰驼亲环素A(cyclophylin A,Cyp-A)的多克隆抗体,为揭示双峰驼体内的黏膜免疫反应机理提供依据。【方法】从GenBank数据库中双峰驼Cyp-A基因序列(登录号:XM_010969543.1)上选取编码区,截取不含信号肽的膜外序列进行碱基优化后,与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET-28a-Cyp-A。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达并对表达条件进行优化,优化诱导条件后通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。纯化重组蛋白并免疫家兔,制备兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,分别使用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性,并采用HE和SABC免疫组化染色法对Cyp-A多克隆抗体进行定位观察。【结果】重组质粒pET-28a-Cyp-A主要以包涵体形式表达,Cyp-A蛋白约为17 ku,最佳诱导条件为0.7 mmol/L IPTG诱导8 h,杂蛋白最佳洗脱液为5 mmol/L咪唑。经ELISA和Western blotting检测,兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体的效价为1∶64000,能特异性识别重组蛋白Cyp-A。经HE和SABC免疫组化染色观察,Cyp-A多克隆抗体仅能使回肠滤泡相关上皮(FAE)中的M细胞特异性着色。【结论】试验成功制备出效价高、特异性强的兔抗双峰驼Cyp-A多克隆抗体,能特异性识别双峰驼回肠中M细胞。

CyP A三类Ig自身抗体测定方法的建立与临床应用

利用基因重组技术，大肠杆菌表达人环胞菌素Ａ结合蛋白（ｒｈＣｙＰＡ），建立测定抗ＣｙＰＡ自身抗体的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），探讨抗ＣｙＰＡ抗体与临床疾病的关系。重组菌可溶性蛋白经饱和硫酸铵盐析和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱层析，获取ｒｈＣｙＰＡ蛋白，用该纯化物作为抗原，方阵滴定，建立ＥＬＩＳＡ技术，对各类自身免疫病进行评估测定。ｒｈＣｙＰＡ经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析，分子量为１８ｋＤ。在系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）患者中，发现有４０．３％的病人检出有抗ＣｙＰＡ自身抗体（５８／１４４），三类Ｉｇ中，又以ＩｇＧ类抗体检出率最为突出，为２８％（４０／１４４）；而其他自身免疫病病人抗ＣｙＰＡ抗体总体检出率为０％～１８．１％。

回、汉族癫痫患者CYP2C9和CYP2C19基因多态性与苯巴比妥血药浓度的相关性研究

目的研究CYP2C9*3和CYP2C19*2的单核苷酸多态性在回、汉族癫痫人群中的分布特点;探讨两种基因型与苯巴比妥血药浓度的关系。方法对宁夏地区回、汉族癫痫患者185例采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)分析CYP2C9*3和CYP2C19*2基因型,并进行回、汉族间基因型及等位基因频率的比较;应用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定其中113例单用苯巴比妥患者的血药浓度,再将其标准化后,分析两种基因型与苯巴比妥血药浓度的关系。结果 (1)回、汉族癫痫患者中CYP2C9*3和CYP2C19*2基因型及等位基因频率均无统计学差异(P>0.05)。(2)根据所携带的CYP2C9和CYP2C19突变等位基因的数量,将113例单用苯巴比妥的患者分为强代谢(EM)组、中间代谢(IM)组和弱代谢(PM)组,IM组和PM组苯巴比妥血药浓度明显高于EM组,且突变基因携带数量与血药浓度呈正相关。结论苯巴比妥血药浓度在CYP2C9和CYP2C19变异基因携带者中增高,根据患者CYP2C9和CYP2C19基因型可以预测患者药物浓度,指导临床选择合适的苯巴比妥初始剂量。