香港牡蛎cyclin B基因组织表达特征及其多克隆抗体制备

【目的】明确香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)B型细胞周期蛋白基因(cyclin B)组织表达特征,并通过原核表达融合蛋白制备多克隆抗体,为探究香港牡蛎cyclin B基因在环境胁迫下的表达特征及揭示cyclin B调控贝类细胞周期的作用机制提供理论依据。【方法】克隆香港牡蛎cyclinB基因c DNA序列,通过SignalP-5.0、ProtParam、TMHMM2.0、NetSurfP2.0及Bioedit7.0等软件进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测cyclinB基因在香港牡蛎不同组织中的表达情况;构建重组质粒pET32a-cyclin B并运用原核表达系统诱导表达融合蛋白,经Ni-NTA镍离子亲和层析柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠源多克隆抗体,然后以间接ELISA检测多克隆抗体效价、Western blotting检测多克隆抗体特异性。【结果】香港牡蛎cyclinB基因cDNA序列全长2353bp,包括1299bp的开放阅读框(ORF)、103 bp的5’非编码区(5’-UTR)和951 bp的3’非编码区(3’-UTR),共编码432个氨基酸残基。香港牡蛎cyclin B蛋白相对分子量为49.13 kD,理论等电点为7.16,不含信号肽和跨膜结构域。香港牡蛎cyclin B氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框,与来自同属的长牡蛎cyclin B氨基酸序列相似性最高(98.8%),基于cyclin B氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示香港牡蛎与长牡蛎的亲缘关系最近。cyclin B基因在香港牡蛎的闭壳肌、外套膜、性腺、鳃、唇瓣、消化腺等组织中均有表达,以性腺中的相对表达量最高,显著高于其他组织中的相对表达量(P<0.05)。通过原核表达获得的融合蛋白cyclin B具备良好免疫原性,且主要以包涵体形式存在;以其免疫BALB/c小鼠制备出的鼠源多克隆抗体效价大于1∶64000,能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白。【结论】香港牡蛎cyclin B基因具有较高的保守性,其氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框;香港牡蛎cyclin B基因表达具有广谱性和组织差异性,在调控生殖细胞减数分裂过程中发挥作用。通过原核表达体系及免疫注射BALB/c小鼠制备获得的cyclin B鼠源多克隆抗体具有高效价,能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白,为进一步探究香港牡蛎cyclin B的生物学功能与表达调控机理提供了技术支持。

Cyclin基因在胃癌患者及其第一代亲属中的表达(英文)

目的 CyclinD和CyclinE的异常表达常引起细胞周期调节异常而导致肿瘤。为阐明这些Cyclin基因在人体胃癌发生、发展过程中的作用 ,本文对 38例胃癌患者、2 9例胃癌的第一代亲属及 18例健康对照者进行了研究。方法 本研究对上述不同组别及相应的病理组织学表现 ,包括肠化生、萎缩、HP感染及胃炎的状况进行了Cyclin基因表达的研究 ,采取逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)的方法。结果 胃癌组织中CyclinD2、D3和E的表达相对于癌旁正常组织明显增高 ,并且CyclinD2和D3的增高表达也发现于胃癌的第一代亲属中 (P <0 0 5 )。不同病理组织学改变 ,肠化生组织CyclinD2、D3和E的表达明显增高 ,胃粘膜萎缩仅CyclinD3表达增高 ,HP感染较未感染组CyclinD2、D3表达增高。但CyclinD1的表达状况与病理组织学改变无关。结论 本研究提示增高的CyclinD2、D3和E是胃癌变过程中的一个常见和早期事件 ,并且基因的异常表达可出现于胃癌患者的第一代亲属中。CyclinD1的表达与胃癌变过程中的临床及病理学变化无明显关系。

玉米cyclin Ⅲ基因的染色体原位杂交物理定位

本文首次报道了玉米低拷贝基因ｃｙｃｌｉｎⅢ（Ｂ－类）生物素标记的染色体原位杂交定位结果。供试探针为该基因的ｃＤＮＡ克隆，其长度仅为１６ｋｂ。结果表明，探针的信号分布在第６染色体短臂和第９染色体长臂，与着丝粒的百分距离分别为７００５±３３１和８６８６±１６４，检出率分别为８２９％和６８３％。文中对基因的物理位置与功能间的关系等作了讨论。

Cyclin E基因蛋白在膀胱移行细胞癌中表达的免疫组化研究

目的 探讨CyclinE蛋白在膀胱移行细胞癌 (BTCC)中表达及与肿瘤临床病理特征之间的关系。 方法 应用鼠抗人CyclinE单克隆抗体对 6 5例BTCC和 12例正常粘膜进行免疫组化SP法染色。 结果 CyclinE在BTCC中阳性表达率随着病理分级 (P <0 .0 5 )和临床分期 (P <0 .0 1)的升高而增高 ,有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组差异非常显著(P <0 .0 1)。结论 CyclinE对BTCC的分化、浸润和转移可能起促进作用。

腹腔热灌注化疗对胃癌患者CyclinE基因表达的影响及临床疗效分析

目的分析腹腔热灌注化疗对胃癌患者CyclinE基因表达的影响及临床疗效。方法选取2014年1月至2017年5月海安县人民医院收治的胃癌术后患者168例,采用随机数字表法分为对照组和观察组,每组84例。对照组采用常规静脉化疗,观察组采用腹腔热灌注化疗,比较两组患者治疗后的疗效、生存质量、外周血肿瘤标志物含量及肿瘤组织中CyclinE、CyclinB2、CyclinD1基因表达情况。结果观察组患者治疗后完全缓解23例,部分缓解25例,总有效率57.14%,对照组完全缓解12例,部分缓解18例,总有效率35.71%,观察组总有效率高于对照组,差异有显著性(P<0.05)。观察组患者治疗后外周血肿瘤标志物DDK1和EXOSC2表达水平低于对照组,PGII表达水平高于对照组,差异有显著性(P<0.05)。观察组患者治疗后肿瘤组织中CyclinE、CyclinB2及CyclinD1基因表达水平低于对照组(P<0.05),总体生活质量高于对照组(P<0.05)。结论腹腔热灌注化疗治疗胃癌术后患者疗效明显,可杀灭胃癌细胞,减少肿瘤标志物释放入血,抑制细胞周期,改善患者生存质量。

BmNPV对家蚕BmN细胞周期及周期蛋白基因表达水平的影响

【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别在感染12,24,36h后,表达量降低为0。流式细胞仪检测结果显示,在BmNPV感染后24h左右,抑制于G2/M期的BmN细胞达到68%。【结论】BmNPV感染家蚕BmN细胞后,导致CyclinB、CyclinE基因表达量降低,对CyclinA基因表达量的影响较小;同时BmNPV感染可以将BmN细胞发育抑制于G2/M期。

siRNA-CyclinE对家蚕细胞增殖的影响

【目的】研究小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞CyclinE基因表达及细胞周期的影响。【方法】合成针对CyclinE基因1 252和568位点的siRNA片段,并利用脂质体法转染家蚕BmN细胞,于共聚焦荧光显微镜下观察转染情况;应用实时荧光定量PCR法检测CyclinE mRNA的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期。【结果】siRNA对家蚕BmN细胞的转染效率达80%左右。转染1252-siRNA-CyclinE和568-siRNA-CyclinE 48h后,分别使家蚕BmN细胞CyclinE mRNA表达量降低了68%和90%;流式细胞仪检测结果显示,2个转染组G0/G1期细胞比例显著增大,S期和G2/M期细胞比例显著减小。【结论】在家蚕BmN细胞中导入针对CyclinE的siRNA,可有效抑制CyclinE基因的表达,使细胞周期阻滞于G1期,进而抑制细胞增殖。

细胞周期蛋白D1基因多态与人结直肠癌遗传易感性

目的探讨细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)基因第870位点单核苷酸多态(G870A)与结直肠癌(colorectal cancer,CRC)遗传易感性的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测345例CRC与670名对照的G870A基因型分布及差异。结果CRC和对照两组人群的Cyclin D1 G870A基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。与GG基因型相比,GA、AA基因型及A等位基因携带者(GA及AA基因型)的CRC风险分别为1.08倍(95%CI=0.75～1.54)、1.01倍(95%CI=0.68～1.51)及1.06倍(95%CI=0.75～1.49)。经性别、年龄、肿瘤位置、组织学分化程度和Dukes分期等因素分层分析,结果均显示G870A与CRC发病风险无显著性相关。结论Cyclin D1 G870A多态与宁波地区人群的CRC发病风险无相关性。

上颌窦鳞癌中CyclinD1和CyclinE的表达及其意义

目的检测上颌窦鳞癌、上颌窦内翻性乳头状瘤及上颌窦炎性黏膜中CyclinD1和CyclinE的表达情况,并分析其表达与上颌窦鳞癌临床病理特性之间的关系。方法应用免疫组化方法检测50例上颌窦鳞癌、20例上颌窦内翻性乳头状瘤、10例上颌窦炎性黏膜中CyclinD1和CyclinE的表达情况。结果在上颌窦鳞癌、上颌窦内翻性乳头状瘤及上颌窦炎性黏膜中,CyclinD1阳性表达率分别为10.0%、25.0%和48.0%(P<0.05);CyclinE阳性表达率分别为20.0%、35.0%和58.0%(P<0.05)。CyclinD1和CyclinE阳性表达率与上颌窦鳞癌患者的性别、T分型无显著相关(P>0.05)。CyclinD1和CyclinE在高、中和低分化的喉癌中阳性表达率组间比较差异无显著性(P均>0.05)。结论在上颌窦炎性黏膜、上颌窦内翻性乳头状瘤及上颌窦鳞癌中,随病变加重,CyclinD1、CyclinE阳性表达率呈逐渐升高的趋势。细胞周期调控网络中,细胞周期调控因子的异常可能是上颌窦鳞癌发生发展的内在原因。

细胞周期调控因子p27、cyclinE和Ki-67在早期胃癌中的表达

目的:探讨早期胃癌中细胞周期调控因子p27、cyclinE和Ki-67表达异常的意义。方法:免疫组织化学(S-P)方法和显微摄像计算机图像分析技术。结果:早期胃癌中,p27阳性23例(42.6％),cyclinE阳性35例(64.8％),细胞增殖指数PI=65.22±9.471。结论:提示p27的低表达,cyclinE的过表达对细胞增殖有促进作用,p27的低表达与cyclinE的过表达与胃癌的发生发展明显相关。

细胞分裂周期蛋白2启动子报告基因载体的构建与鉴定

目的构建细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,并检测其转录活性。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的Cdc2启动子序列并设计两端引物,扩增人基因组DNA中的Cdc2启动子。用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和Cdc2启动子后,将Cdc2基因启动子插入到pGL3-Basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-Cdc2-promoter。将其与内参质粒pRL-SV40瞬时共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测双荧光素酶活性。结果成功构建Cdc2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Cdc2-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-Cdc2-promoter/pRL-SV40组荧光素酶活性为1.591 5±0.199 8,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40组的荧光素酶活性值0.049 9±0.010 4。结论 pGL3-Cdc2-promoter在骨髓瘤细胞U2OS细胞中能被转录激活,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。

三角帆蚌cyclin B基因克隆及功能

通过现代分子生物学技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)中克隆了细胞周期蛋白B(cyclin B)基因的cDNA,得到长度为1024 bp的序列信息,包括768 bp的ORF,197 bp的3′-UTR,编码255个Aa。进一步分析表明,三角帆蚌cyclin B基因与牡蛎、扇贝具有较高的相似性,其氨基酸序列中具有1个典型的周期蛋白框(cyclin-box),并存在2个周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的作用位点。通过RT-qPCR研究显示:三角帆蚌cyclin B基因在性腺中的表达最高,在雌性中的表达量显著高于雄性(P<0.05);而cyclin B基因在其他组织中的表达量均显著低于性腺(P<0.05),且无显著雌雄差异(P>0.05);沉默cyclin B基因后,除外套膜外,其在性腺和鳃的表达显著降低(P<0.05),表明RNA干扰(RNAi)对三角帆蚌不同组织具有不同的沉默效果。流式细胞仪测定RNAi后细胞的分裂时相变化,发现性腺和鳃细胞中G2/M期占比下降,表明cyclin B基因在三角帆蚌中能调控细胞分裂。初步研究了三角帆蚌cyclin B基因及其功能,为三角帆蚌细胞体外建系奠定分子基础。

乳腺癌组织CCNA1启动子区甲基化与肿瘤转移的相关性

目的:探讨CCNA1基因甲基化在乳腺癌发生发展中的作用。方法:采用Qiagen-FFPE的步骤提取95例石蜡包埋乳腺癌组织的基因组DNA,应用限制性酶切-PCR对所提DNA进行CCNA1甲基化检测。结果:乳腺癌组织中CCNA1基因启动子甲基化的阳性率为90.9%(86/95)。结论:CCNA1基因甲基化参与乳腺癌的发生,发展,有淋巴结转移多见的特征,CCNA1基因甲基化与乳腺癌转移由关。