棉花内生细菌YUPP-10及其分泌蛋白CGTase对棉花枯萎病的防治作用及机理

【目的】棉花枯萎病(Fusarium wilt)是棉花种植中较为严重的土传病害之一,主要采用化学方法进行防治,但对环境和人畜安全造成一定影响。生物防治因其专一性强、安全性高的特点,成为防治棉花枯萎病的重要途径。本研究旨在获得一株高效拮抗细菌,并明确其防治机理,为棉花枯萎病生物防治提供技术支持。【方法】前期获得一株能够破坏β-1,4糖苷键的棉花内生蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)YUPP-10,通过平板对峙培养、共培养法和悬滴法分别测试其对棉花枯萎病菌(尖镰孢,Fusarium oxysporum)菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响;利用YUPP-10菌液浸种处理,研究其对棉花生物量的影响;以尖镰孢菌土为基质种植棉花,生长1周后,用LB液体培养基培养的YUPP-10制成不同浓度(分别为1×10^(8)、1×10^(7)和1×10^(6) cfu/mL)的生防菌剂灌根处理棉苗,于温室中进行棉花枯萎病的防治效果研究;通过Fosmid文库筛选到了YUPP-10关键抑菌物质为环糊精糖基转移酶(CGTase,EC 2.4.1.19),研究其对尖镰孢菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响;利用拟南芥花序侵染法将其转化拟南芥,获得能够稳定表达CGTase的转基因株系,研究转基因拟南芥对枯萎病的抗性,以及在病原胁迫下部分防御基因的转录。【结果】YUPP-10菌株发酵液对尖镰孢菌丝生长、产孢和孢子萌发具有显著的抑制作用,随着发酵液浓度的升高,对尖镰孢产孢量和孢子萌发的抑制率越高,最高抑制率分别为98.41%和51.65%。低浓度的YUPP-10菌液能促进棉花种子发芽、出苗和地上部分的生长。YUPP-10发酵液灌根处理后,棉苗的病情指数和病株率显著降低,其中,1×10^(7) cfu/mL的YUPP-10发酵液对棉花枯萎病的防治效果最高,达到45.11%。YUPP-10菌株的关键抑菌物质CGTase能够水解羧甲基纤维素和葡甘聚糖,表明其具有破坏β-1,4糖苷键的能力,进而检测了其对尖镰孢的抑制效果,结果表明CGTase对尖镰孢的菌丝生长、产孢和孢子萌发具有显著的抑制作用,对产孢和孢子萌发的最高抑制率分别达到62.63%和30.83%。转CGTase的拟南芥提高了对枯萎病的抗性,过表达CGTase的拟南芥在病原胁迫下部分防御基因的转录水平升高。【结论】蜡状芽孢杆菌YUPP-10菌株能抑制尖镰孢的生长、促进棉花部分生物量指标的增长并控制枯萎病的危害,CGTase能够抑制尖镰孢的生长,转CGTase拟南芥对枯萎病的抗性增强。

利用来源于Paenibacillus macerans的α-CGTase突变体Y89D制备α-环糊精

对α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)突变体Y89D制备α-环糊精的影响因素进行初步研究。其因素包括淀粉种类(马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、可溶性淀粉)、加酶量、反应时间、pH值、有机溶剂(乙醇、异丙醇、正丁醇、正癸醇)和温度。结果表明:选用5g/100mL马铃薯淀粉、pH5.0、温度30℃、加酶量控制在每克淀粉5U左右,反应体系中加入体积分数5%的正癸醇,反应6h后,淀粉总转化率可达70%,其中α-环糊精在产物中质量分数约为85%,转化产物中含有少量β-环糊精(15%),而极少生成γ-环糊精。因此,α-CGTase突变体Y89D在制备α-环糊精工艺中具有很好的工业化应用前景。

大环糊精的酶法制备及应用研究进展

大环糊精(large ring cyclodextrin,LR-CD)是由9个至数百个吡喃葡萄糖单元组成的环状α-1,4-葡聚糖,主要通过环糊精葡萄糖基转移酶或4-α-糖基转移酶的环化作用使直链淀粉发生分子内转糖基作用得到。与常见α-、β-、γ-环糊精(cyclodextrin,CD)相比,LR-CD的空腔尺寸更大,表现出独有的结构和理化特性,这些性质使LR-CD在食品、医药、生物等领域展现出巨大的应用潜力。然而,LR-CD的制备成本高,产率较低,并且缺乏有效的分离纯化方法,因此目前还未实现工业化生产与应用。本文分别从优化底物、设计基于模板诱导的新反应路径、酶分子改造及产物的分离纯化等方面综述酶法制备LR-CD的研究近况与挑战,为LR-CD的工业化生产和应用提供参考。

乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase的影响

以重组环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)表达菌株BL21(DE3)作为研究对象,比较IPTG和乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase量的影响,确定优化诱导方式。以Geobacillus CHB1的基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆CGTase基因;利用分子操作技术构建携带有大肠杆菌Omp A信号肽的分泌型表达质粒p EASY-E2-Omp A-CGT,重组质粒热激转化至Escherichia coli BL21中进行表达;在摇瓶发酵条件下,分别以IPTG和乳糖作为诱导剂,通过SDSPAGE分析和测定胞外酶活,确定优化诱导方式。CGTase基因在Escherichia coli BL21中实现表达,且具有一定量的重组CGTase分泌至胞外;乳糖诱导的蛋白表达量优于IPTG诱导,不易形成包涵体;乳糖最佳的诱导起始菌浓度OD600为1.4,诱导浓度、温度分别为0.5%和25℃,分批流加乳糖5次和一次性加入,重组CGTase表达量无明显差异;经初步优化,胞外酶活达19.87 U/m L。Geobacillus CHB1 CGTase基因在大肠杆菌中成功实现胞外表达,乳糖可替代IPTG诱导重组CGTase。

环糊精糖基转移酶JSL-1的鉴定及功能研究

环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)可以通过环化反应催化淀粉及其衍生物生成环糊精(Cyclodextrin,CDs)。研究通过基因工程技术手段,成功获得东洋芽孢杆菌Bacillus toyonensi s P18中环糊精糖基转移酶JSL-1蛋白,探讨其产物特异性及酶学性质。同时,将JSL-1基因超表达到日本晴水稻中,研究环糊精糖基转移酶JSL-1对水稻淀粉质量的影响。结果表明,JSL-1主要催化淀粉生成α-CD,其最适反应pH和最适反应温度分别是8.0和50℃。随着JSL-1表达水平的增加,水稻中直链淀粉含量及老化程度下降,透光率及冻融稳定性增加,有利于提高水稻的食味品质以及外观品质等特性。总之,对环糊精糖基转移酶JSL-1的研究有利于环糊精生产工艺的改良以及水稻品质的提升。

重组Bacillus stearothermophilusβ-CGTase在β-环糊精制备中的应用条件优化

以作者所在实验室前期构建的产嗜热脂肪芽孢杆菌β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)重组短小芽孢杆菌作为菌种,经过摇瓶发酵,得到酶活为49 U/mL的β-CGTase粗酶液。以马铃薯淀粉为底物用β-CGTase进行单酶法转化制备β-环糊精,并对转化条件进行优化。结果表明,最优反应条件为:反应时间18 h,初始pH 6.0,反应温度50℃,底物质量浓度15 g/dL,加酶量13 U/g底物。在最优条件下,总转化率最高为73.9%,其中β-环糊精比例为98.7%。在此基础上,建立了采用普鲁兰酶与β-CGTase复配同步转化淀粉制备β-环糊精的新工艺,并且优化了普鲁兰酶的加酶量。结果表明,当普鲁兰酶加量为50 U/g淀粉底物,反应时间18 h时,总转化率达到最高81.4%,其中β-环糊精占比97.7%。

超高压对α-CGTase产物专一性的影响

探讨了不同压力、不同温度对于α-CGTase产物专一性的影响,以及高压处理过后反应不同时间产物专一性的变化,确定了超高压作用于α-CGTase后环化反应产物专一性的变化规律。结果表明:在40℃,200 MPa下超高压不仅可显著提高α-CGTase产物专一性,同时保持较高酶活与产物得率。在40℃条件下,不同压力处理α-CGTase,随着压力升高,α-CGTase环化活力逐渐降低,反应产物专一性不断提高;在200 MPa下,不同温度处理α-CGTase,酶环化活力随温度升高而降低,产物专一性随温度升高先升高后降低;此外,高压处理α-CGTase后产物专一性随着反应时间的延长而降低。

环糊精葡萄糖基转移酶的生产及其分离纯化研究进展

环糊精因其特殊的性质而备受食品、化妆品和制药等行业的青睐。对环糊精的巨大需求也使其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase,EC2.4.1.19)成为人们关注的热点。目前,对该酶的研究多集中在作用机制、菌株筛选等方面,从发酵生产到分离提纯的系统性报道并不多见,因此,结合国内外对CGTase的大量研究工作和中国的资源优势,笔者以CGTase的发酵生产和分离提纯为出发点,以环糊精产业未来的商业需求为基础,对优质CGTase的发酵生产和提纯方法进行了综述,同时对该领域的未来研究进行了展望。

环糊精的性能、生产及其在食品工业中的应用

本文介绍了环糊精的结构、性能、生产方法及其在食品工业中的应用等。

环糊精系列综述之一 环糊精葡萄糖基转移酶的筛选及其定向改造

环糊精因其特殊性质得到了食品、化妆品、医药等行业的青睐,全球消费量逐年稳步增加。环糊精的巨大需求也使其生产中所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶,EC 2.4.1.19)成为研究热点。目前,对该酶的研究多集中在作用机制、产物专一性机理等,鲜见从菌株筛选出发的系统性报道。因此,作者从野生CGT酶菌株的筛选出发,立足未来环糊精工业的商业诉求,综述了优质CGT酶获取的多种途径。同时结合国内外对CGT酶的大量研究工作以及我国的资源优势,对该领域未来的研究提出更高的期望。

γ-环状糊精葡萄糖基转移酶产生菌32-3-10产酶条件及酶促反应条件的研究

筛选到一株芽胞杆菌 32 - 3- 10 ,它所产γ -环状糊精葡萄糖基转移酶可以淀粉为底物生成γ -环状糊精 ,对其产酶条件及酶促反应条件进行了研究。

响应面分析法优化β-环糊精的制备工艺

该文对β-环糊精制备工艺用响应面分析法优化进行了研究。结果表明,生产β-环糊精的最佳条件是选取木薯淀粉作为底物,不经过预处理,环状糊精葡萄糖基转移酶添加量是7U/g,环己烷的添加量0.5mL/g,体系CaCl2的浓度是50mmol/L,pH值8.25,温度63.72℃,反应时间9.04h,产率可达51.98%。优化后的生产工艺和传统工艺相比,反应时间缩短了5h,并且产率增高了1.13倍。

环糊精糖基转移酶高产菌株的快速筛选

以酚酞作指示剂 ,在琼脂固态培养基上 ,根据酚酞变为无色所形成变色圈大小筛选环糊精糖基转移酶高产突变株是一种平板快速筛选方法。嗜碱芽孢杆菌 1177菌株经紫外线和γ射线诱变处理后 .经该法筛选得到突变株圈 7- 12 ,该菌株产环糊精糖基转移酶达 5 6 0 0u/ml,较出发菌株提高 183%。连续 5代传代试验表明 ,突变株 7-

环糊精葡萄糖基转移酶工业发酵染菌(Bacillus cohnii strain PGRS7)的鉴定及防治

环糊精生产厂家β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltransferase,β-CGTase)发酵过程中频繁染菌,为解决这一问题,从发酵异常的发酵液中分离得到1株不产酶的杂菌H03S。研究杂菌发酵过程中的菌体密度、pH值、酶活等指标,发现杂菌生长速度明显低于正常菌,发酵液pH值下降速度也慢于正常菌。结合厂家实际生产情况分析:若发酵过程规范操作,则正常菌会优先形成生长优势,抑制杂菌生长;如果发酵罐实消后放置时间过长或者突发停电导致发酵终止后重新启动,杂菌会形成优势菌群,降低发酵液pH值,不利于正常菌的增殖。16S rDNA鉴定杂菌序列与正常菌不同,应归属于Bacillus cohnii strain PGRS7。因此,发酵前应预先采用16S rDNA分析鉴定菌种,排除杂菌,避免发酵中断和延迟,防止发酵染菌。

嗜碱芽孢杆菌产环糊精葡萄糖基转移酶发酵条件的优化

对一株嗜碱芽孢杆菌产环糊精糖基转移酶的发酵条件进行了研究。利用单因素试验和正交试验获得该菌株产环糊精糖基转移酶的最佳条件为:接种量3%;培养温度30℃;pH10.5;发酵培养基的组成为玉米粉2%,酵母膏1.5%,玉米浆5%;250ml三角瓶装液量为30ml;270r/min振荡培养3d,其发酵液酶活可达5400U/ml左右。10L罐发酵时酶活可达5820U/ml。

生淀粉生产环糊精的研究

介绍了以马铃薯生淀粉生产环糊精的方法。对生淀粉生产过程中的马铃薯、玉米、木薯生淀粉转化做了比较 ,并对反应条件对转化的影响做了研究。

环糊精酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

为实现环糊精酶在毕赤酵母中的高效表达,以优化合成的环糊精酶基CGT2为基础,构建组成型表达质粒pGAPZαA-CGT2,运用电转化方法将目的基因整合进酵母染色体,构建环糊精酶酵母工程菌X33/pGAPZαA-CGT2,经摇瓶发酵120h后,CGT2活力达0.21 U·mL^(-1);进一步对工程菌进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH6.5、28℃、200r·min^(-1)、每24h补加2.5%的甘油,120h后其胞外酶活力达到0.36U·mL^(-1),是优化前的1.7倍,实现了环糊精酶在毕赤酵母中的组成型表达。

金属离子协同氨基酸提高重组β-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的表达

随着环糊精的应用越来越广,其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19,简称CGT酶)已成为研究热点。为了克服天然菌种产环糊精葡萄糖基转移酶(CGT)能力低等缺陷,该文将来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶基因插入质粒p ST中,构建了分泌型表达载体cgt/p ST并在宿主B.subtilis WB600中成功表达;通过对摇瓶发酵产CGT酶的条件进行优化发现,当发酵培养基为TB,p H为7.0时,37℃培养48 h后胞外酶活力达到27.9 U/m L,与天然菌株B.circulans STB01在较优发酵条件下所分泌的胞外酶活力相比,提高了近19倍;对TB培养基碳源、氮源进一步优化,以6 g/L的玉米淀粉替代TB培养基中的甘油,以30 g/L的酵母提取物作为氮源,胞外酶活可达到31.2 U/m L;亮氨酸、天冬氨酸的添加能明显促进β-CGT酶的胞外表达,而0.5mmol/L Fe3+的添加能进一步将胞外酶活提高到36.9 U/m L。这是目前报道的β-CGT酶在B.subtilis中胞外表达的最高β-环化活力。

嗜热芽孢杆菌CHB1环糊精酶基因优化及其在毕赤酵母中的表达

为实现新型CGTase在毕赤酵母中的高效表达,提取嗜热芽孢杆菌CHB1基因组DNA为模块,PCR扩增野生型基因CGT1,编码680个氨基酸。将该基因进行密码子优化CGT2,与野生型基因CGT1分别插入分泌型载体pPICZαA转化毕赤酵母GS115,获得两株酵母工程菌GS115/pPICZαA-CGT1和GS115/pPICZαA-CGT2;经甲醇诱导表达120 h后,CGT2活力达0.62U/mL,是优化前CGT1(0.37 U/mL)活性的1.7倍;进一步对GS115/pPICZαA-CGT2进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH 6.5、28℃、200 r/min、每24小时补加体积分数1.5%的甲醇诱导,120 h后其胞外酶活力达到1.26 U/mL,是优化前的两倍。

环糊精葡萄糖基转移酶的性质、应用与固定化研究进展

本文总结了环糊精葡萄糖基转移酶的性质、应用与固定化研究的进展情况，引用文献４７篇。