斑节对虾亲环素A(cyclophilinA)基因的克隆及启动子序列分析

通过同源克隆和RACE技术获得斑节对虾(Penaeus monodon)亲环素A(cyclophilin A,CYPA)的cDNA序列。根据已克隆的cDNA序列设计引物,利用染色体步移技术(Genomic DNA walking)从斑节对虾卵巢组织中克隆了CYPA基因的启动子和基因组DNA序列。测序结果表明,斑节对虾亲环素A(PmCYPA)cDNA全长834bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为495bp,可编码164个氨基酸;5’非编码区为31bp,3’非编码区为308bp。从斑节对虾基因组文库中扩增的CYPA基因组DNA全长3181bp,其中包括启动子区域1173bp,1个内含子426bp,2个外显子序列:分别为101bp和399bp。在5’UTR上游区域有明显的启动子序列,包含一个GC盒和2个CAAT盒,同时还包含AP1、CRE等调控元件,符合真核生物典型的启动子特征。分析基因的结构表明所克隆的PmCYPA符合PPlase家族成员特征,属于此基因家族成员。

日本血吸虫Sj CyclophilinA基因的克隆、表达及其生物学功能研究

【目的】克隆和表达了日本血吸虫CyclophilinA(Sj CyPA)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7天童虫消减cDNA文库中,PCR扩增一EST序列的基因全长cDNA,提交到NCBI,登录号为GQ403666。应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达。诱导、表达、纯化和复性重组蛋白,测定其PPIase活性。利用Western blot检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。【结果】PCR获得了Sj CyPA编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为519bp。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在13d童虫表达量最高,为童虫期高表达基因。构建了重组表达质粒pET28a(+)-Sj CyPA,并在大肠杆菌中成功表达。复性重组蛋白具有PPIase活性。Western blot试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得18.72%的减虫率和44.6%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPA基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPA原核重组表达质粒,在大肠杆菌中成功表达,纯化复性得到有PPIase活性的Sj CyPA重组蛋白,并证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。

胃癌组织中亲环素A表达与肿瘤细胞体外化疗药物敏感性的关系

目的分析胃癌组织中亲环素A(CypA)表达与肿瘤细胞体外化疗药物敏感性及耐药相关蛋白的关系,并探讨其意义。方法磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)法检测94例胃癌组织对氟尿嘧啶(5-FU)、奥沙利铂(L-OHP)、阿霉素(ADR)的体外化疗药物敏感性;对相应石蜡标本进行免疫组化染色,检测CypA蛋白及耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、谷胱甘肽-S-转移酶-π(Glutathione S-transferase-π,GST-π)、x-IAP、Survivin的表达。结果 CypA、P-gp、GST-π、x-IAP、Survivin阳性表达率分别为72.3%(68/94)、90.4%(85/94)、62.8%(59/94)、66.0%(62/94)、76.6%(72/94),均明显高于癌旁组织(均P<0.05)。5-FU、L-OHP对CypA强表达的肿瘤细胞抑制率低于弱表达者(均P<0.05),而CypA的表达情况与ADR对肿瘤细胞的抑制率无明显关系(P>0.05)。相关分析显示,CypA蛋白与P-gp、x-IAP、Survivin均存在正相关关系(均P<0.05)。结论胃癌细胞对5-FU、L-OHP药物敏感性与CypA蛋白表达有关,该作用可能是CypA调节部分耐药相关蛋白实现的。

亲环素A及脑梗死相关血液指标与颈动脉粥样硬化斑块形成和稳定性及脑梗死的相关性研究

目的探究亲环素A(Cyclophilin A,CyPA)及脑梗死相关血液指标与颈动脉粥样硬化斑块形成和稳定性之间的关系,从而探究其与脑梗死的相关性。方法收集河北医科大学第二医院神经内科2017年12月~2018年12月就诊的患者脑梗死组56例,斑块组(无梗死,仅有斑块)患者72例,无斑块组40例;各组中斑块的稳定程度用斑块评分来表示,斑块评分越高斑块越不稳定;应用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)测定CyPA含量,并收集一些常见血液指标数据;应用颈动脉超声检测颈动脉斑块并根据超声中颈动脉斑块的形态确定斑块评分。结果无斑块组和斑块组CyPA水平差异有统计学意义(P<0.05),CyPA是颈动脉斑块形成的危险因素(OR=1.002,95%CI 0.824~1.219);脑梗死组和斑块组中CyPA水平与颈动脉斑块评分(颈动脉斑块稳定性)之间无相关性(P>0.05);斑块组与脑梗死组的斑块评分差异有统计学意义(P<0.05)。脑梗死组中纤维蛋白原、糖化血红蛋白与斑块评分呈正相关,血红蛋白与斑块评分之间呈负相关,且有统计学意义(P<0.05)。经Logistics回归后,纤维蛋白原是动脉粥样硬化斑块发展的独立危险因素(OR=8.988,95%CI 3.017~3.422)。血红蛋白是动脉粥样硬化斑块发展的保护因素(OR=0.936,95%CI 134.031~144.583);斑块组中高密度脂蛋白与斑块评分呈负相关,差异有统计学意义。经Logistic回归分析后,高密度脂蛋白是动脉粥样硬化斑块发展的保护因素(OR=0.052,95%CI 1.237~1.364)。结论血清中CyPA水平是颈动脉粥样硬化斑块形成的危险因素,但与斑块的稳定性不相关;脑梗死患者中的斑块不稳定程度较非脑梗死患者斑块不稳定程度明显增加;对于急性脑梗死的患者纤维蛋白原、糖化血红蛋白都与颈动脉斑块的稳定程度呈负相关,血红蛋白含量与斑块稳定性呈正相关,其中纤维蛋白原是动脉粥样硬化斑块发展的独立危险因素,血红蛋白是动脉粥样硬化斑块发展的保护因素;在非脑梗死患者中,高密度脂蛋白与斑块的稳定程度呈正相关且是斑块发展的保护因素。

亲环素A对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响及机制研究

目的探讨亲环素A（CyPA）对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡影响及可能的作用机制。方法将PCI2细胞分为正常对照组（0μmol／L Aβ25-35）、Aβ25-35诱导组（10μmol／LAβ5-35）和药物保护组（0．1、1、10、100nmol／LCyPA＋10μmol／LAβ25-35），药物保护组采用相应浓度CyPA预处理PCI2细胞30min，再加入AB535继续培养。MTT法分析细胞存活率，Hoechst33258染色法检测细胞凋亡，RT-PCR检测Bcl-2和BoxmRNA表达，Western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白表达。结果1、10和100nm01／LCyPA可提高细胞的存活率，减少Aβ25-35引起的细胞凋亡，增加Bcl-2mRNA表达以及Bcl-2蛋白表达，降低BaxmRNA表达以及Bax蛋白表达，与Aβ25-35诱导组比较差异有统计学意义（P〈0．05），且CyPA剂量越高效果越明显。结论CyPA可剂量依赖性对抗Aβ25-35对PCI2细胞的毒性作用，减少细胞凋亡，其机制与上调抗凋亡基因Bcl-2表达和下调凋亡基因Bax表达有关。