气候变暖致使墨兰(Cymbidium sinense)野外种群趋向灭绝

温室效应和气候变化通过影响植物生长发育和水分循环过程,对植物的生存产生重大影响,特别是与环境高度适应的兰科植物。通过对深圳野生墨兰(Cymbidium sinense)的生物学特征调查和生殖行为观察,计算出其各龄级的存活数、出现频率和子代数以及空间分布格局,编制种群静态生命表和生殖力表、绘制存活曲线和年龄锥体,构建Leslie矩阵模型、Levins模型和连续下降模型Nt=Nt-1-Nt-1e-2.329对种群数量动态过程进行预测,结合气象数据分析,以检验墨兰种群对气候变化的响应。结果表明:在气温上升引发相对湿度降低和降雨失衡形成干旱的环境条件下,墨兰表现出的空间结构为成群分布,种群的年龄锥体属于壶型锥体,种群存活表现近似于DeeveyⅠ型,种群的净增长率、内禀增长率和周限增长率很低,墨兰种群正处于下降态势。究其原因是,墨兰在生理上表现出对干旱的敏感和高温使光合速率下降,影响营养物质积累以及高温直接抑制花芽分化或造成花芽败育,从而影响了有性繁殖,减少了后代的生产。尽管其有性繁殖是通过花香和花外蜜吸引中华蜜蜂(Apiscerana)传粉,产生含有大量种子的果实。但只有少量种子可以在野外环境中萌发,而萌发出的幼苗大多数因干旱不能成长到有性繁殖阶段。墨兰的种群数量动态随气候的波动而波动的结果证明了气候暖化和降雨失衡引起的干旱影响着墨兰的生殖和生长过程,成为其种群发展的致死因子。这种作用的持续或进一步加剧将使墨兰在该地区消失,因此,有必要对该物种进行迁地保护或种质资源人工保存。墨兰对气候变化的响应应引起人们对全球暖化给植物生存所带来的威胁的关注。

墨兰CsAP1-A基因克隆及表达分析

【目的】AP1基因在植物的花器官发育和开花调控中发挥重要作用,对墨兰AP1基因进行克隆与表达分析可为研究其在墨兰花发育和开花调控中的作用提供前期基础。【方法】以墨兰品种‘小香’为材料,克隆到1个AP1基因,命名为CsAP1-A。通过生物信息学分析其基因结构、蛋白结构域和进化关系,利用RTqPCR方法分别检测CsAP1-A在墨兰不同器官、不同花发育阶段和不同花组织部位的表达情况;通过转录组测序分析CsAP1-A在5个不同花型墨兰品种花组织部位的表达情况;通过蛋白互作预测软件分析CsAP1-A与其他蛋白的互作关系。【结果】CsAP1-A基因编码区为744 bp,编码248个氨基酸,含有高度保守的MADS-box和K-box结构域,符合MADS-box转录因子家族特征。CsAP1-A与其他兰科植物AP1蛋白相似性较高,其中与春兰AP1/FUL3(APY18447.1)和蕙兰MADS1(AGE15496.1)的同源性最高。RT-qPCR分析结果表明,CsAP1-A在墨兰不同器官中均有表达,在花中表达量最高,且集中在花芽分化初期(S1)高表达。在不同花型的墨兰品种中,CsAP1-A在WT(普通型)、MPV(重瓣花型)、LaPV(花瓣唇瓣化花型)和NLV(唇瓣萼片化花型)4种花型的合蕊柱中表达量均最高,而在萼片中表达量最低;在合蕊柱异常发育的MPV中,CsAP1-A在合蕊柱的表达量显著提高,而在花瓣蕊柱化的梅瓣花型(GPV)中整体表达量最高,且表达区域从合蕊柱扩展到花瓣。蛋白互作预测CsAP1-A蛋白可与MADS1、MADS6、MADS47、MADS8等10个蛋白存在互作关系。【结论】墨兰CsAP1-A的基因结构、进化关系、时空表达情况和蛋白互作预测可为墨兰花发育的研究提供理论依据,对进一步揭示CsAP1-A基因在墨兰成花过程中的作用奠定基础。

基于HS-SPME-GC-MS分析墨兰不同花器官香气成分

墨兰(Cymbidiumsinense)为典型的香花国兰,具有很高的经济价值和观赏价值。采用HS-SPME-GC-MS技术对墨兰不同花器官的挥发性成分进行分析,共检测出7类、54种挥发性成分,主要由21种醛类、12种醇类、10种酮类、5种苯类、2种呋喃类、2种酸类及2种萜类化合物组成。花瓣、萼片、唇瓣、蕊柱等4种不同花器官均含有的化合物共48种,包括19种醛类、10种醇类、9种酮类、5种苯类、2种萜类、2种呋喃类和1种酸类。花瓣、萼片及蕊柱共有成分有3种,只在萼片中检测到的成分仅有2种,丙烯醛只在蕊柱中检测出。结果表明:花朵不同花器官所含的挥发物种类及含量差异明显,萼片共检测出49种挥发物,物质含量最高达99106.15μg/L,占总挥发性有机成分的35.88%,其中含量最高的挥发物为环戊基甲醛,具有薄荷的樟脑味。花瓣共检测出51种挥发物,物质含量为56571.48μg/L,占总挥发性有机成分的20.48%,含量最高的挥发物为1-戊烯-3-醇,具有水果香味。唇瓣共检测出48种挥发物,物质含量最低的为41645.32μg/L,占总挥发性有机成分的15.08%,其中含量最高的挥发物为环戊基甲醛。蕊柱共检测出具有香气成分的挥发物51种,物质含量为78868.68μg/L,占总挥发性有机成分的28.56%,其中含量最高的挥发物为己醛,具有生的油脂、青草气及苹果香味。通过主成分分析发现4种花器官中唇瓣和花瓣差异性小,蕊柱和萼片与其他器官差异性大。戊醛、己醛、E-2-戊烯醛、E-2-己烯醛、环戊基甲醛、E-2-庚烯醛、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇是4个花器官香气释放的主要挥发性成分。盛花期墨兰花朵的萼片是挥发性成分释放的主要花器官,不同花器官花香成分的物质含量存在明显差异。

墨兰AP3基因过表达载体构建及遗传转化铁皮石斛

为探讨墨兰(Cymbidium sinense)AP3基因在兰花唇瓣中的功能,基于前期从墨兰转录组中得到的AP3基因序列,通过PCR技术构建墨兰AP3基因过表达载体,利用农杆菌EHA105转化铁皮石斛(Dendrobium officinale)原球茎,建立遗传转化体系。经PCR验证,20棵抗性苗中获得9棵阳性苗,其阳性苗率达45%,成功将墨兰AP3基因导入铁皮石斛。

墨兰‘潮州素荷’高效栽培技术初探

试验选用墨兰‘潮州素荷’的新老成苗作为母苗,分别在人工气候室与栽培大棚内进行栽培对比试验。经过2个月的培养,结果表明,在主要气候因子中,人工气候室内的昼夜温差和高光照量有利于‘潮州素荷’的叶芽与新根的分化,其新老成苗的叶芽增殖、新根增殖和叶片营养含量明显优于栽培大棚。人工气候室栽培的新老成苗新长叶芽数倍率分别是栽培大棚的2.0倍与1.4倍,新长根数倍率分别是栽培大棚的3.7倍与2.0倍。用Duncan法进行显著性分析比较得出,人工气候室的叶绿素含量相对值与氮含量均显著(P<0.05)高于大棚。因此,本次试验为墨兰在人工气候室内高效栽培技术提供了新的方向,为后续高价值墨兰的高效栽培提供技术支持。

墨兰与大花蕙兰种间杂种原球茎的诱导及增殖研究

利用墨兰与大花蕙兰进行种间杂交 ,成功获得了 5个组合的杂种原球茎和植株。墨兰×大花蕙兰及大花蕙兰×墨兰 ,均以原球茎方式萌发。以墨兰×大花蕙兰的杂种原球茎为材料 ,通过L9(34)正交设计研究了NH4NO3 、KH2 PO4、 6 BA和NAA等因素对杂种原球茎增殖的影响 ,发现NAA对原球茎的增殖影响不大 ,NH4NO3 16 5 0mg·L-1(MS正常浓度水平 ) ,提高KH2 PO4浓度 (170～ 85 0mg·L-1)和 6 BA浓度 (1～ 10mg·L-1)有利于原球茎的增殖。 9个培养基中以MS +NH4NO3 16 5 0mg·L-1+KH2 PO4340mg·L-1+6 BA 10mg·L-1效果最好。

墨兰组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒(CymMv)的研究

对墨兰原球茎顶端分生组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒(CymMv)病原的效果进行了研究.取1～2 mm大小的墨兰原球茎顶端分生组织,经0,20和40 mg·L-1的三氮唑核苷浸泡15 min处理和继代培养,诱导再生植株.RT-PCR检测表明:从带病叶样提取的RNA经反向转录和PCR扩增反应,在琼脂糖凝胶电泳中检测到长为767 bp的CymMv病原特异扩增产物,而健康墨兰叶样中未检测到该扩增产物.单纯利用原球茎顶端分生组织培养获得的试管苗,脱毒率为72.9%;原球茎顶端分生组织经过20 mg·L-1的三氮唑核苷处理,可以获得100%的无病毒苗.虽然三氮唑核苷处理造成原球茎顶端分生组织细胞一定程度的伤害,但经过5～6个月的培养,分生组织能恢复生长,不定芽能有效地增殖,并获得了再生植株.当三氮唑核苷处理浓度为40 mg·L-1时,原球茎的顶端分生组织出现透明和褐变现象,细胞活力难以恢复.

墨兰根状茎绿芽分化的研究

对影响墨兰根状茎绿芽分化的几个因素进行研究的结果表明 :在基本培养基中添加 5 .0 0mg·L-16 -BA +0 5 0mg·L-1NAA的激素配比 ,绿芽产率高达 1 80 % ,且绿芽生长势旺盛 低剂量 (1和 2Gy ) 60 Coγ -射线辐射可促进根状茎绿芽分化 ,提高绿芽产率和生长势 ;高剂量 (5～ 1 0Gy )辐射则显著降低绿芽产率 ,使其生长势减弱 活性炭完全抑制绿芽分化 。

墨兰、春兰变种和品种间同工酶分析

通过酯酶 (EST)、苹果酸酶 (ME)、磷酸葡萄糖异构酶〔PGI(NADP)〕、磷酸葡萄糖变位酶〔PGM(NAD)〕、超氧化物歧化酶 (SOD) 5种酶系统研究墨兰和春兰 17个变种及品种的同工酶多样性 ,并探讨这些材料间的亲缘关系。 5种酶系统所得的 11个位点中 7个是多态性位点。EST、PGM(NAD)和SOD具有多态性。上述 5种酶系统能够把供试品种和变种区分开 ,并划分为墨兰和春兰类。

大花蕙兰与兰属植物种间杂交研究

进行了大花蕙兰、墨兰、建兰、纹瓣兰、兔耳兰等兰属植物的种间远缘杂交实验。在52个杂交组合中,86.5%的杂交组合具明显的子房膨大和果荚发育,但授粉4个月后未变黄落果的杂交果仅占组合数32.7%,经胚胎培养获得植株的杂交组合只占组合数的19.2%。大花蕙兰×墨兰与墨兰×大花蕙兰的杂交成功率有较大的差异。

广东四个墨兰品种的核型研究

研究了广东四个墨兰品种金嘴墨兰、银边墨兰、企剑黑墨和企剑白墨的染色体数目和核型。结果表明,企剑黑墨和企剑白墨的染色体数目为2n=40,为二倍体,核型公式分别为:2n=2x=40=30m+10sm和2n=2x=40=2M+36m+2st;金嘴墨兰和银边墨兰的染色体数目为2n=41,为非整倍体。4个墨兰品种的染色体结构主要由中部着丝粒染色体组成,除银边墨兰为1B型外,其它均为2B型。

墨兰多倍体的离体诱导和鉴定

以墨兰‘企剑白墨’的根状茎为材料,研究秋水仙素处理对墨兰根状茎生长和多倍体诱导的影响。结果表明,秋水仙素对根状茎有严重的毒害致死作用,在试验浓度和时间范围内,随着秋水仙素浓度的升高或处理时间的延长,根状茎存活率明显降低。秋水仙素能诱导‘企剑白墨’根状茎的染色体加倍,但不同浓度和时间处理的染色体加倍效率不一样。只在0.01%×3天处理下诱导出四倍体,诱导率为11.11%,其余处理诱导出二、四混倍体,诱导率在0.00%～19.44%之间。四倍体根状茎比二倍体粗壮,顶端更圆,再生出的四倍体植株株型紧凑,叶片质地变硬,根明显增粗。

几种花叶线艺兰叶片色斑色素组成和叶绿体超微结构研究

以墨兰Cym bidium sinense3个花叶线艺兰品种金嘴、阳明锦和大石门为材料,分析了叶片色斑区叶绿素和类胡萝卜素的质量分数,对其解剖结构和叶绿体超微结构进行了观察,并同叶片正常绿色区进行了比较.结果表明:线艺兰叶斑的形成与叶绿素和类胡萝卜素的质量分数有直接的关系,叶片绿色区金嘴、阳明锦和大石门叶绿素质量分数分别为1.680、1.279和1.584 mg.g-1,类胡萝卜素质量分数分别为0.185、0.159和0.195 mg.g-1,绿色区金嘴、阳明锦和大石门类胡萝卜素与叶绿素质量分数的比值分别为0.110、0.124和0.123;而在叶片黄色区,金嘴、阳明锦和大石门叶绿素质量分数分别为0.693、0.465和0.540 mg.g-1,类胡萝卜素的质量分数分别为0.145、0.136和0.164 mg.g-1,类胡萝卜素与叶绿素质量分数的比值分别为0.209、0.292和0.304.即黄色区类胡萝卜素相对质量分数较高.绿色区和黄色区的叶绿素a与b比值变化不大,但在3个品种中都以绿色区稍高.在叶片绿色部分的细胞中,可以明显看到较多的叶绿体,叶绿体中基粒较发达,类囊体膜垛叠较紧密,有较多较大的淀粉粒;而在叶片黄斑部分的细胞中,基本上看不到完整叶绿体,淀粉粒逐渐消失,基质中存在很多嗜锇滴.

^(60)Coγ射线辐照对墨兰根状茎生长和分化的效应研究

本文报道了用60 Coγ射线辐照对墨兰根状茎生长和分化的效应。结果表明 ,低剂量 (0 2、0 5、8Gy)辐照能促进根状茎旺盛生长 ,随着辐射剂量的增大 ,根状茎的生长受到抑制 ,甚至死亡 ;低剂量辐照根状茎 ,其绿芽分化能力未受影响。对辐照根状茎生化指标的分析表明 ,低剂量 (2、5、8Gy)辐照使根状茎体内可溶性蛋白质含量增加明显 ,过氧化物酶 (POD)活性的变化趋势不一 ,2和 5Gy的低剂量辐照使根状茎POD活性稍有降低 ,8Gy的辐照使POD活性显著升高 ,说明一定水平的低剂量可诱导根状茎POD活性增强 。

墨兰原球茎生长的研究

以墨兰种子胚经培养诱导萌发形成的原球茎为材料，研究其生长的最适条件。结果表明：最佳基本培养基是ＭＳ培养基；ＮＡＡ０．５ｍｇＬ＋ＢＡ１．０ｍｇＬ－１有利于生长和分化；在培养基中加入１％蔗糖和０．１％活性炭最有利于原球茎生长；ｐＨ５．０偏酸环境适合于生长；每天给予１５．５ｕｍｏｌｍ－２Ｓ－１１６ｈ的光照最佳。如将上述单因子组合在一起，其原球茎鲜重增长率比对照（ＭＳ培养基）高４６％。在不同切割方式中，掰开法鲜重增长率比纵切法或横切法都高。

墨兰及其杂种的组织培养与快速繁殖

针对墨兰及其杂种常规分株繁殖慢、种子在自然状况下极难萌发的情况，以仙殿白墨及其它与象牙白、西藏虎头兰杂交所得的杂种的胚，仙殿白墨与其杂种Ｆ１代的茎尖、花芽、幼叶、根进行离体培养。结果表明，胚培养以１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋１０％椰子汁培养基萌发效果较好，发育到一定时期的早期胚即能萌发；茎尖、花芽培养在ＭＳ＋６－ＢＡ０５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０５ｍｇ／Ｌ＋０５％活性炭培养基上诱导原球茎比较适合，根与幼叶离体培养未诱导出原球茎；根状茎增殖在以花宝一号、花宝二号、蛋白胨等为主要原料并附加０５％活性炭的自制Ｇ３培养基上长得粗壮且繁殖速度快；根状茎出芽诱导在Ｂ５＋６－ＢＡ２～３ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０２ｍｇ／Ｌ＋０５％活性炭培养基上效果最好；生根壮苗以１／２ＭＳ＋ＮＡＡ２０ｍｇ／Ｌ＋１０％苹果汁＋１０％香蕉汁＋１０％活性炭培养基能达到较理想的效果；蔗糖浓度生根培养时以２％较佳，其它培养以３％较好。仙殿白墨杂交种的胚萌发率比仙殿白墨略低，萌发期略长；但其花芽与茎尖的原球茎诱导、根状体增殖、根状茎出芽、生根壮苗培养、生长势、抗逆性等方面均具有杂种优势。

墨兰叶片结构及光合作用的研究

墨兰（Cymbidium sinense（Andr.）Willd.）叶片外有较厚的角质和蜡质。气孔分布于叶背面,密度为100—130mm-2,气孔上覆有气孔盖。叶肉没有海绵组织与栅栏组织的分化,维管束鞘细胞中无叶绿体。叶片叶绿体基粒较发达,有较多的亲锇颗粒。功能叶最高量子产率为0.082左右。光合作用光补偿点约为5μE·m-1·s-1,光饱和点大约为200 μE·m-2·s-1。墨兰的光合速率很低,一般在2.0—2.6.μmol CO2·m-2·s-1,一年生叶片光合作用最适温度大约在25℃,而3年生叶片光合速率随温度的上升而下降。叶片叶绿素a/b值基本稳定在2.7左右。墨兰CO2补偿点在105—220ppm之间。实验结果说明、墨兰属于低光合速率,高CO2补偿点的典型阴生植物。所以,墨兰生长极其缓慢。

中国墨兰品种遗传多样性的AFLP分析

利用AFLP分析技术，从64对PstI／MseI引物中筛选出9对多态性引物组合，对来源于中国广东、福建、台湾的42个墨兰品种进行了遗传多样性和亲缘关系分析，共扩增出1384条带，其中多态性带1333条，多态性率96．3％。平均每对引物扩增带数154条、多态性带数148条。所有的品种均可区分，其中39个品种具特征带或缺失带。墨兰品种间的遗传多样性丰富，品种间的Dice相似系数0．4222～0．8245，平均相似系数0．6112。“达摩”系列芽变叶艺品种间的遗传多样性显著降低，多态性率76．6％，平均相似系数0．7256。NTSYS2．10聚类分析表明同一产地来源的品种基本上可聚在一起，反映出了品种间的亲缘关系。

PP_（333）对墨兰生长发育和叶片结构的影响

以不同浓度ＰＰ３３３溶液喷施墨兰２～４次，１００ｍｇ／ｋｇＰＰ３３３处理可使墨兰叶片短、宽且厚，叶色浓绿，有光泽，叶较挺直，新芽多，单株花数多，从而改善观花赏叶价值。

墨兰的解剖学研究

运用石蜡切片法和扫描电镜技术,对墨兰营养器官和生殖器官进行了研究。结果表明墨兰叶片表面具较厚的角质层。气孔多为四轮列型,分布在下表皮。叶肉没有海绵组织和栅栏组织的分化,但叶尖部和叶中部中脉附近的叶肉细胞常伸长,类似栅栏组织细胞。平行脉,外韧型维管束。在假鳞茎中,维管束散生在基本组织中。根具根被、皮层和维管柱三部分。花被各部分基本结构均相似。唇瓣和合蕊柱的表皮为腺表皮,具花柱道。三心皮雌蕊,一室,侧膜胎座。四合花粉,表面无纹饰。蒴果。