濒危莲瓣兰杂交育种及原生地种子萌发的研究

以莲瓣兰‘大雪素’(Cymbidium tortisepalum‘Daxuesu’)和‘剑阳蝶’(Cymbidium tortisepalum‘Jianyang-die’)为亲本,研究莲瓣兰种间杂交育种、杂交种子在原生地播种共生萌发及植株形态发生过程,为莲瓣兰杂交育种新品种选育及杂交种子原生地播种种苗快速繁殖奠定基础。结果表明,莲瓣兰种间杂交结实率在90.0%～93.3%之间,杂交亲和性较强;莲瓣兰杂交种子在原生地播种6～12月后,能被萌发菌侵染、种胚突破种皮形成类原球茎,种子在原生地播种容易萌发;类原球茎转绿成根状茎、根状茎伸长成丛生型根状茎、丛生型根状茎顶端分生组织分化出原球茎、原球茎分化出叶和根、根状茎逐渐退化完成植株再生过程极其缓慢,需要4～6年的时间。

兰属春剑叶艺突变体叶片结构的研究

以兰属春剑(Cymbidium tortisepalum Fukuy.var.longibracteatum)叶色突变体‘隆昌素’及其亲本为材料,采用石蜡切片、扫描电镜及透射电镜对叶片的组织结构、扫描结构和超微结构进行了观察。结果显示,春剑叶色突变体叶片的表皮厚度和叶肉细胞面积均大于亲本,但导管数量少于亲本;叶片上、下表皮纹饰与亲本具有明显差异;气孔密度和面积均小于亲本,且气孔闭合度较大,占总气孔数的56%;突变体的叶绿体呈高密度的囊泡状结构,内部严重解体,体积较小的嗜锇滴聚集分布,无基粒片层,无淀粉粒。本研究表明经组培诱变的春剑叶色突变体的叶片结构与亲本存在明显差异。

莲瓣兰形态变异研究

莲瓣兰是分布于云南西北部、四川西南部和台湾的濒危兰花。本研究采用引种不同种群的莲瓣兰栽培在相同环境中的植株为实验材料,测定其形态性状并进行统计计算,分析莲瓣兰种群之间的形态变异以及亲缘关系。巢氏方差分析结果显示,莲瓣兰19个表型性状居群间方差百分比为22.162%,居群内方差百分比为77.838%,莲瓣兰形态变异主要来源于居群内;聚类分析显示保山施甸(SD),大理云龙形态(YL)较为接近,春剑贵州兴隆(XL)居群形态与莲瓣兰各居群差别较大,距离较远。研究结果可为莲瓣兰的类群划分、良种选育及野生资源的保护提供基础数据。

莲瓣兰DALP遗传多样性研究

采用DALP(Direct amplification of length polymorphism)检测莲瓣兰5个居群的遗传结构。5个引物组合共检测到103个多态位点。和其它具有相似生活史(多年生草本、以动物为媒介的杂交、种子随风散布)的物种相比,莲瓣兰原变种水平(PPB=88.18%,A=1.8818,Ae=1.4880,H=0.2911,I=0.4412)和物种水平(PPB=93.64%,A=1.9364,Ae=1.5262,H=0.3129,I=0.4732)均具有较高的遗传多样性;各居群间(Gst=0.3292)存在较大的遗传分化。基因流的估计值(Nm=1.0186)表明莲瓣兰物种水平上各居群间每代有1.0186个移居个体。地理隔离和选择压力可能是造成莲瓣兰居群间基因流动受到限制的原因。在这些研究的基础上,探讨了野生莲瓣兰资源的保护问题。

云南莲瓣兰主栽品种SSR指纹图谱的构建和遗传差异分析

为了解云南莲瓣兰（Cymbidium tortisepalum）的遗传多样性，利用SSR技术对32个莲瓣兰主栽品种进行遗传变异分析，并构建莲瓣兰栽培品种的指纹图谱。结果表明，筛选出的12对多态性高、稳定性好的引物共检测到95个等位基因，每对引物检测到4~18个等位基因，有效等位基因数（NE）为61.489，平均有效等位基因数（NA）为5.124，Shannon信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）分别为0.806~2.624和0.789~0.953。12对引物中，以引物SSR03的等位基因数、NE、观测杂合度、I和PIC最高。32个品种在12对引物上都具有不同的特异性条带，可以彼此区别。从12对引物中筛选出3对核心引物SSR02、SSR03和SSR12构建了莲瓣兰主栽品种SSR分子指纹图谱，这3对核心引物组合即可鉴定32个莲瓣兰栽培品种。这为莲瓣兰的品种鉴定、遗传多样性分析和分子育种研究提供理论基础和技术支持。

杀菌剂对莲瓣兰种子原生地萌发胚培养中真菌污染控制的研究

[目的]研究不同杀菌剂对莲瓣兰杂交种子原生地共生萌发突破种皮的胚培养过程中真菌污染控制及胚培养成活情况的影响。[方法]以莲瓣兰杂交种子原生地共生萌发突破种皮的胚为外植体,分别用1.0g/L代森锰锌、1.0g/L多菌灵、1.0g/L甲霜灵和1.0mg/L培福朗预处理外植体5min,再按常规灭菌后将外植体接种到改良RM培养基中在适宜条件下培养,观察胚培养过程中真菌污染控制及胚培养成活情况。[结果]莲瓣兰杂交种子原生地共生萌发突破种皮的胚经1.0g/L代森锰锌和1.0mg/L培福朗预处理5min,胚培养过程中真菌污染率控制在10.0%以内,显著优于无处理的对照组(CK);代森锰锌处理胚培养成活率较低,胚培养成活率仅为67.5%,培福朗处理胚培养成活率显著高于代森锰锌,胚培养成活率高达84.8%。[结论]培福朗是莲瓣兰胚培养理想的杀菌剂。

兰属中若干分类群的订正

基于对许多活植物的观察 ,对兰科中兰属的若干种类进行了分类学考订 ,结果承认菅草兰Cym bidiumtortisepalum与峨眉春蕙C .omeiense为独立的种 ,将春剑C .longibracteatum移至菅草兰之下作为变种 ,送春C .szechuanicum移至莎叶兰C .cyperifolium之下作为变种。由于春剑、峨眉春蕙和送春的模式标本及引证标本已在 30多年前全部丢失 ,本文指定了新模式。

莲瓣兰与大花蕙兰“黄金薄荷”种间杂种胚培养研究

以莲瓣兰为母本,大花蕙兰"黄金薄荷"为父本进行杂交,并对杂种胚进行无菌萌发。成功建立了该杂交组合的组培快繁体系,为进一步开展其种质创新提供了基础条件。

莲瓣兰大雪素SOC1基因克隆和系统发育分析

控制植物开花的途径有光周期现象、GA、春化途径、自主途径等,在光周期途径中,CO基因促进开花通过直接上调FT和SOC 1基因表达,SOC 1基因是MADS-box基因家族中控制开花时间的基因,在花发育过程中起重要作用。本研究以莲瓣兰大雪素为实验材料,用RACE方法快速地克隆全长c DNA,生物信息学分析全长c DNA为912 b,具有完整的开放阅读框(ORF)672 bp,编码223氨基酸的蛋白质,通过系统发育分析获得一个SOC 1同源基因。本实验为进一步对这个基因的功能研究奠定了基础。

珍稀濒危莲瓣兰组织培养试管苗移栽的研究

以莲瓣兰‘苍江大雪素’组织培养生根试管苗为试材,研究移栽基质、移栽时间、试管苗大小对莲瓣兰试管苗移栽的影响。结果表明:在大理3月和9月份莲瓣兰试管苗移栽成活率最高,二者无显著差异,3月份移栽根系生长显著优于9月份,是一年中移栽的最佳时期;栗树叶作为移栽基质莲瓣兰试管苗移栽成活率和生根显著优于水苔、珍珠岩、红仙土和碎树皮,水苔、珍珠岩和红仙土不宜作为莲瓣兰试管苗的移栽基质;莲瓣兰试管苗大小对移栽成活率及生根影响较大,中苗移栽成活率显著优于大苗和小苗,大苗移栽生根优于中苗,小苗移栽难生根。

云南迪庆州野生莲瓣兰形态分异与海拔的关系

迪庆州位于云南省西北部滇、藏、川三省区交界处,具有丰富的地质地貌多样性、生物多样性和自然景观多样性。境内的维西傈僳族自治县至德钦县的一段区域是野生莲瓣兰的重要分布区之一,本研究于2013年8月1—25日在该区域进行实地调查,采集野生莲瓣兰资源,共发现14个野生莲瓣兰居群,并测定株高、叶长和叶宽等形态特征。结果表明:野生莲瓣兰的株高、叶长、叶宽与分布地海拔高度呈显著的负相关关系(P<0.05),表现为海拔越高,其叶片越窄(R2=0.724 8),植株越矮(R2=0.581 2),叶片越短(R2=0.463 4);但海拔高度对莲瓣兰的叶片数量影响较小;明确提出维西傈僳族自治县的西北坡向、西坡向和北部坡向是野生莲瓣兰的主要分布区。研究结果阐明了该区域海拔等生境因子对野生莲瓣兰形态特征的影响,为进一步深入研究和保护野生莲瓣兰资源奠定了基础。

莲瓣兰保育现状与开发利用

总结了莲瓣兰分布特点、资源保护、引种驯化、人工栽培与研究现状,认为目前存在着居群恢复困难、人为破坏严重、保护和研发投入不足等问题。提出进行资源调查和应采取的保护措施,加强对莲瓣兰科学研究,加大对兰文化、兰花产业宣传力度,以促进莲瓣兰产业的持续、健康发展。

莲瓣兰大雪素SEP1基因克隆和表达的研究

随着植物中越来越多的MADS-box基因被克隆出来,人们对经典的ABC模型进行了改进和完善,提出花发育的ABCDE模型,其中SEP1、SEP2、SEP3、SEP4为E类基因,SEP1同源基因在花器官的形成过程中起至关重要的作用。本研究以莲瓣兰大雪素作为实验材料,用RACE方法快速地克隆全长cDNA,生物信息学分析全长cDNA为1047bp,具有完整的开放阅读框(ORF)753bp,编码250氨基酸的蛋白质,获得一个SEP1同源基因。通过基因表达在各个授粉前和授粉后3d的合蕊柱中。本研究为进一步对这个基因的功能研究奠定基础。

莲瓣兰大雪素AP1 MADS-box基因的克隆和系统发育分析

随着植物中越来越多的MADS-box基因被克隆出来,人们对经典的ABC模型进行了改进和完善,提出花发育的ABCDE模型,通过RT-PCR和RACE技术从莲瓣兰大雪素花器官中克隆得到AP1同源基因AP1a和AP1b的cDNA全长:AP1a基因全长为1 054bp,其开放阅读框为744bp;AP1b基因全长为944bp,其开放阅读框为516bp。从莲瓣兰大雪素中得到2个AP1同源基因,说明在大雪素中AP1出现基因松弛,所以出现多个拷贝。通过序列比对以及系统发育分析表明,莲瓣兰AP1a基因与春兰具有很高的相似度,达到99.1%,莲瓣兰AP1b基因与萼脊兰具有中等程度的相似度,达75.8%,但从大雪素花器官提取的同源基因AP1a和AP1b的相似度很低,仅为65.4%。这表明AP1基因在不同品种植物间具有保守性,而在同一个物种中又存在着功能的分化。

莲瓣兰原生地萌发胚培养真菌污染的控制

以莲瓣兰杂交种子原生地共生萌发突破种皮后的胚为材料,研究氯化汞浓度、灭菌时间及超声波处理时间对莲瓣兰胚培养过程中真菌污染控制及胚成活情况的影响。结果表明,莲瓣兰杂交种子原生地共生萌发突破种皮后的胚灭菌过程中氯化汞浓度越高、灭菌时间和超声波处理时间越长,胚培养过程中真菌污染率越低,但是对胚造成的损伤程度高、胚成活率低。较适宜的灭菌方法是氯化汞浓度0.20%、灭菌时间10～15min、超声波处理时间4～6min,胚污染率控制在15.0%以内,胚成活率达到80.0%以上。

杀菌剂在莲瓣兰原生地萌发胚培养中的应用

以莲瓣兰杂交种子原生地播种萌发突破种皮后的胚为外植体,研究了培养基中添加不同种类、不同浓度的杀菌剂对胚培养过程中真菌污染的控制作用。结果表明:培养基中添加培福朗、苯菌灵和代森锰锌能有效控制莲瓣兰杂交种子原生地萌发突破种皮后的胚培养过程中的真菌污染,胚污染率可以控制在10.0%以内,培养基中添加培福朗时胚成活率显著高于添加苯菌灵和代森锰锌,胚成活率高达92.4%;培养基中培福朗浓度在0.5～1.0mg/L范围内时胚污染率能够控制在9.0%以内,胚成活率超过92.3%,不仅能有效控制莲瓣兰杂交种子原生地萌发突破种皮后的胚培养过程中真菌污染,还能促进胚生长发育转绿成根状茎。

莲瓣兰繁育方式研究

莲瓣兰是中国传统兰花,主要分布在云南西北部、四川西南部和台湾.本研究试图从繁育系统方面对莲瓣兰进行研究,从而为有效保护和合理开发野生莲瓣兰资源提供科学依据.通过对4个莲瓣兰居群进行授粉试验,结果表明:莲瓣兰自体授精结实率为1%,人工自交结实率为96%,人工杂交结实率为90%.莲瓣兰是自交亲和的,但在天然条件下的有性繁殖主要依靠媒介传粉.大理(YL)和福贡(FG)居群间的杂交结实率均为100%,而保山(BS)和维西(WX)居群间的杂交结实率分别为73%和77%.

云南野生莲瓣兰资源研究进展和科研思考

云南野生莲瓣兰主要分布于云南大理、怒江、保山、迪庆和丽江等州、市。由于莲瓣兰植株形态优美,花形多变,花色丰富,市场价格居高,莲瓣兰野生资源遭到了毁灭式的采挖,导致资源濒危。目前对莲瓣兰的研究主要集中在组织培养及共生菌、莲瓣兰的鉴赏和栽培技术、莲瓣兰形态特征的多样性和居群结构等方面。本文在总结现有研究成果的基础上,指出了莲瓣兰资源研究和利用方面存在的问题,提出了开展进一步研究的建议:(1)利用分子生物学技术开展莲瓣兰保护遗传学研究;(2)利用遗传学方法研究莲瓣兰主要特征特性的遗传规律;(3)利用生态学方法研究野生莲瓣兰的适应机理及环境响应策略;(4)开展育种理论和技术的研究。

基于流式细胞技术两种兰属植物基因组大小的测定

基于流式细胞技术对兰属中莲瓣兰和墨兰的基因组大小进行测定,采用Galbraith′s缓冲液解离并制备莲瓣兰和墨兰嫩叶材料的细胞核悬浮液,利用鸡红细胞核(chicken erythocyte nuclei,CEN)作为内标,建立和优化了基于流式细胞技术的两种兰属植物基因组大小的测定方法。研究发现Galbraith’s解离液对莲瓣兰和墨兰样品解离效果最好,测得莲瓣兰的2 C值为(8.15±0.34)pg,墨兰基因组DNA的2 C值为(8.34±0.36)pg。研究结果表明,基于流式细胞技术,优化解离和测定方法可精确测定莲瓣兰和墨兰的基因组大小。本研究丰富了兰科植物的基因库,为揭示该属植物C值大小和物种进化关系提供重要依据,也为其基因组学、分子细胞遗传学等研究奠定基础。

莲瓣兰“滇梅”根状茎的增殖与分化技术研究

[目的]研究莲瓣兰"滇梅"(Cymbidium tortisepalum‘Dian Mei’)根状茎的增殖与分化技术,为提升莲瓣兰的苗体质量和大规模化产业化生产提供良好的理论依据和技术支撑。[方法]以莲瓣兰"滇梅"根状茎为试验材料,研究不同植物生长调节剂6-BA、CPPU、TDZ和活性炭对"滇梅"根状茎增殖和分化的影响。[结果]选用1/2MS培养基为基本培养基,"滇梅"根状茎增殖的最佳配方为2.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭。"滇梅"根状茎分化的最佳配方为2.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA同时培养基中不增添活性炭。添加活性炭对于"滇梅"根状茎的分化有抑制作用。[结论]TDZ作为一种高效植物生长调节剂对于莲瓣兰"滇梅"根状茎的增殖分化有显著的效果,明显优于其他植物生长调节剂。