一种新的分子标记方法——随机微卫星扩增多态DNA(RMAPD)

随机微卫星扩增多态DNA(RMAPD)是利用随机引物和微卫星的上游或下游引物一起作为该扩增的引物,在TaqDNA聚合酶、MgC l2、dNTPs和模板DNA等共同作用下进行PCR扩增的一种新型分子标记方法。其核心是RMAPD引物的有效性问题。通过对西农萨能奶山羊群体RMAPD电泳检测、数据统计分析及验证实验等证明RMAPD的引物是有效的。通过与微卫星和RAPD标记比较,发现RMAPD标记在扩增引物、扩增程序和重复性等方面区别于微卫星和RAPD标记;它是RAPD标记的一种广义的延伸,但又不完全等同于RAPD标记。因此,确定RMAPD是一种新的分子标记方法。该方法也具有DNA标记的特点,在群体遗传结构和亲缘关系分析以及标记辅助选择等动物遗传育种领域具有广阔的应用前景。

兰属Cymbidium植物ISSR遗传多样性分析

将简单重复序列区间扩增多态标记(inter-simple sequence repeats,ISSR)技术应用于16种兰属的遗传多样性分析,15个引物共扩增出836条带,其中有227条多态带,多态百分比为27.2%。UPGMA聚类结果显示:春兰与春剑的亲缘关系最近,而兔耳兰与其他15种兰属植物的距离最远。ISSR聚类结果与传统分类结果基本相似,表明该技术能在分子水平上对传统兰属分类进行必要补充。

朱鹮随机微卫星扩增多态DNA(RMAPD)研究

首次利用RMAPD标记对43只洋县人工饲养朱鹮群体的遗传多态性进行了分析。结果表明,RMAPD技术的稳定性与多态性比RAPD高。12对引物共扩增出2147条带纹,93条具有多态性。朱鹮的条带共享率为0.718,遗传多样性指数为3.664,反映群体内个体间相似程度较高,遗传多态性较低,需要加强对朱鹮的遗传多样性保护。

应用RMAPD分子标记技术研究兰属植物间的亲缘关系(简报)

兰属是兰科兰族萼足兰亚族的一个属。全世界约有兰属植物70种，主要分布于亚洲热带与亚热带地区，向南到澳大利亚北部。根据Du Puv＆Cribb分类系统，我国有49种兰属植物和一些变种,产于秦岭以南各省。我国兰花的市场交易额巨大。这是由于兰属植物不仅具较高的观赏价值。还具重要的药用价值。

西农萨能奶山羊随机微卫星扩增多态DNA(RMAPD)与经济性状的相关性

利用随机微卫星扩增多态DNA（RMAPD）技术分析69只西农萨能奶山羊基因组DNA的多态性与产奶性状（第1～5胎产奶量和平均产奶量）、产羔数（第1～5胎产羔数和平均产羔数）和体尺指标（初生重、成年体重、胸围、管围、体高、体斜长）的相关性.RMAPD与3个经济性状的相关性结果表明：66个标记条带分别对产奶量、产羔数及初生重、体重、体高等体尺指标有显著或极显著的标记效应（P〈0.05, P〈0.01）.其中,23个标记条带（14个正向效应标记和9个负向效应标记）与产奶量有关, HEL1r＋F09的C、D、J、K和L带对第3～5胎及平均产奶量有显著的标记效应,尤其是J带对第5胎产奶量有极显著的正向标记效应; 23个标记条带（11个正向效应标记和12个负向效应标记）与产羔数有关,HEL1r＋F09的J带、MFW20f＋P4的H带、HEL1f＋F09的E带和MFW20f＋F09的A、D带对产羔数有极显著的标记效应;20个标记条带（9个正向效应标记和11个负向效应标记）与体尺指标有关,HEL1f＋F09的G带、HEL1r＋F09的E带对初生重有极显著的标记效应,HEL1r＋OPW19的M带对胸围有极显著的标记效应 （P〈0.01）.

蓖麻种质资源多样性AP-PCR与RMAPD分析

为了研究国内主要商业蓖麻品种的种质资源多样性，采用AP—PCR与RMAPD分子标记方法，对来自国内不同地区的31份蓖麻品种进行分析。AP—PCR分子标记的研究结果表明，9条引物扩增的条带为5—12条，共计82条带，平均每条引物扩增出9．1条带，扩增的多态性条带为2。10条，多态率为40％．90．91％，共计53条带，平均每条引物扩增出5．89条多态性带。在9条引物中，引物S3扩增出多态性条带最高，多态率达90．91％。蓖麻种质资源的RMAPD分析结果表明，84对引物扩增的条带为5～12条，共计85条带，平均每对引物扩增出8．5条带，扩增的多态性条带为3。10条，共计56条带，平均每条引物扩增出5．6条多态性带。在84对引物中，引物A3＋B4扩增出的条带最多，多态性最高，多态率达83．3％。对AP—PCR与RMAPD分子标记的数据进行联合聚类分析表明，在遗传系数为0．56处，31份蓖麻种质被分成3大类群。2种分子标记之间的相关系数不显著（R=0．0093）。

建兰转录本的微卫星序列和单核苷酸多态性信息分析

利用建兰转录组数据对其微卫星序列又称简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)进行搜索,并对其所在序列进行注释,从而为建兰分子标记的开发提供有效信息.利用High-Seq技术对建兰转录组进行深度测序,采取从头拼接策略进行拼接,最后得到了101 423个转录产物,其中含139 385 689bp,平均长度为1 374bp.在这个转录组数据库中一共检测到17 793个SSR和16 676个SNP位点,它们的平均密度分别是1.28个SSRs/10kb和1.20个SNPs/10kb.在这些SSR中,除了单核苷酸重复外,二核苷酸和三核苷酸重复是最主流的类型,分别占了所有SSR的20.46%和21.98%.在SNP中,C和T之间以及A和G之间的替换是最主要的形式,分别占了所有SNP的30.80%和28.81%.另外,对含有SSR和SNP序列注释发现:分别有1 748个SSR和1 932个SNP序列具有直系同源基因簇(Clusters of Orthologous Groups,COG)注释;4 994个SSR和4 819个SNP序列具有基因本体论(Gene Ontology,GO)注释;2 107个SSR和2 188个SNP序列具有京都基因与基因组百科(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)注释.这些序列涉及了许多重要的生物功能和代谢途径,预示着这些潜在的标记可能与重要的生物功能有关.这些信息为建兰分子标记的开发和应用奠定了基础.

建兰DNA的快速提取

用SDS高盐提取介质简便快速提取建兰(Cymbidiumensifolium)嫩叶DNA.提得的DNA分子大小约为48kb,A260/A280=1.77～1.86,DNA得率为每g鲜叶410～1145μg.提取的DNA无需经RNase处理,可直接用于限制性内切酶酶切和随机扩增多态DNA反应.

兰花SRAP指纹图谱的构建

以兰花的叶片、花瓣、根系为材料,用改进后的CTAB+Tris-HCl洗涤法、CTAB法、SDS+Tris-HCl洗涤法、SDS法均获得HMW基因组DNA。其中,CTAB+Tris-HCl洗涤法提取的DNA纯度较高,其操作简单,并能有效地将兰花叶中富含的酚类、多糖类物质去除,使得提取出DNA的纯度、浓度都符合SRAP分析要求,取材也最方便。研究获得了兰花的清晰SRAP指纹图谱,为SRAP的相关研究提供参考。

杂交兰EST-SSR标记在国兰中的通用性及多态性分析

【目的】探索杂交兰EST-SSR标记在国兰中的通用性,为国兰寻找新的分子标记,并利用这些新标记分析国兰的种间遗传多样性,以期为国兰的品种鉴定和种质资源的合理利用奠定基础。【方法】以建兰、墨兰、春兰等国兰44个品种为试验材料,对240对杂交兰EST-SSR标记引物的通用性进行研究。在此基础上,通过筛选的引物对国兰的遗传多样性进行分析。【结果】杂交兰240对EST-SSR引物在国兰中的通用性比例分别为春兰(67.92%)、建兰(66.25%)、墨兰(71.25%)。利用其中的17对引物对44份国兰品种资源进行分子系统发育研究,有10对引物表现出多态性,10对引物共扩增出52个条带,多态性条带数为3~9个,多态性信息含量分布范围为0.504~0.850。聚类分析结果表明,44个国兰品种可分为4大聚类群,分类结果与传统的植物学分类相吻合。【结论】本研究发掘的杂交兰EST-SSR引物可以有效用于国兰的分子遗传多样性研究。

寒兰转录组SSR信息分析及其分子标记开发

寒兰(Cymbidium kanran)是中国传统名花,其观赏与经济价值极高。简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),又名微卫星标记,有多态性高,非共显性等优势。基于转录组数据对SSR标记的开发具有经济效能高等优点,通过高通量测序平台对寒兰EST-SSR标记进行开发,了解其在转录组序列中的分布类型及特性,为寒兰的SSR多样性的分析及遗传图谱构建奠定基础。通过MISA程序筛选寒兰转录组测序得到的68699条unigene(序列总长60.06 Mb),并分析了其SSR位点分布情况,获得了9837个SSR位点,在总unigene的比例为14.32%,平均每6.25kb出现1个SSR。SSR位点中二核苷酸重复频率达到最高,占55.22%,其中AG/CT高达38.83%;接下来为三、单核苷酸重复,频率依次为25.37%和14.49%。利用Primer3共设计出6017对SSR引物。随机选取141对引物进行PCR扩增,有79对引物扩增得到的条带清晰可重复,15对在15个不同地区寒兰中表现出多态性。结果表明,本研究中设计的SSR引物在寒兰遗传多样性分析中具有较高的适用性,可用于寒兰的遗传研究。

杂交兰转录组SSR信息分析及EST-SSR标记开发应用

该研究主要开发筛选适用于杂交兰的EST-SSR引物,为杂交兰种质资源评价和遗传变异研究等提供可靠的分子标记。该研究对杂交兰进行转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并对不同种质的遗传多样性进行分析。结果表明,从31724条杂交兰Unigene中检测出18603个SSR位点,SSR出现频率为58.64%;SSR位点中的主导类型是单核苷酸重复,占总SSR的65.10%,其次是二核苷酸(23.56%)和三核苷酸(10.76%)重复;优势重复基元为A/T、AG/CT、AT/AT和AAG/CTT,分别占总位点的64.72%、13.74%、8.19%和2.51%。利用Primer Premier 5.0共设计了565对SSR引物,从筛选出的64对有效扩增引物中随机选择28对引物,对40份杂交兰种质进行多态性验证与遗传关系分析,其中16对(占57.14%)引物表现出可重复的高多态性,平均多态信息量(PIC)达0.789。基于扩增的多态性SSR信息,40份种质资源可聚为4类,聚类结果与其遗传背景基本一致。该研究印证了转录组测序获得的Unigene是SSR标记开发的有效来源,开发的EST-SSR引物可为杂交兰及近缘种的良种鉴别、遗传图谱构建、分子标记辅助育种及功能基因挖掘等提供有价值的候选标记。