虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

采用RT-PCR、PCR-SSCP等分子生物学技术和关联分析等方法对虾夷马粪海胆Strongylocentrotusintermedius CYP51基因的cDNA序列进行了克隆和单核苷酸多态性分析。结果表明:虾夷马粪海胆的CYP51基因包括一个1 491 bp的开放阅读框,编码496个氨基酸;其开放阅读框的第161个核苷酸处存在1个单核苷酸多态性,即核苷酸发生了A→G突变。关联分析结果表明,该单核苷酸多态性与虾夷马粪海胆的体质量、性腺质量之间存在显著相关性(P<0.05)。本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列并进行了SNPs分析,研究结果可为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考。

中国大鲵Cyp51基因特征与性腺表达分析

采用RT-PCR法从大鲵( Andrias davidianus )性腺中分离获得 Cyp51 基因全长cDNA 1 975 bp, 5′端非编码区135 bp, 3′端非编码区331 bp,开放阅读框( ORF)1 509 bp,编码503氨基酸。生物信息学分析显示, Cyp51 基因编码蛋白的二级结构含有50.20%的α-螺旋,9.96%的延伸链,3.59%的β-转角,36.25%的无规则卷曲。系统进化树显示,大鲵与两栖类中的热带爪蟾和非洲爪蟾同源性最高,与其它物种也有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示, Cyp51 基因在卵巢、肝、肾等组织表达水平显著性高于其它各组织;性腺发育不同时期表达结果显示, Cyp51 基因在1-5Y卵巢中表达显著性高于精巢,在6Y时无显著性差异;在雌性与伪雌性性腺中表达水平显著高于雄性及伪雄性性腺。结果表明 Cyp51 基因对大鲵的性腺分化,尤其是卵巢发育有着重要作用。

耐唑类白色假丝酵母菌临床株CYP51基因的研究

目的探讨白色假丝酵母菌临床株CYP51基因突变与对唑类抗真菌药物耐药的关系,从分子水平了解白色假丝酵母菌的耐药机制。方法纸片扩散法初步筛选呼吸道感染对耐唑类白色假丝酵母菌,按NCCLS公布的M-27方案测定初筛耐药株对氟康唑和伊曲康唑的MIC,设计3对引物,对分离的2株耐唑类白色假丝酵母菌(2007H株,2007T株)进行PCR,扩增CYP51基因;扩增产物纯化后,进行测序并与GenBank序列(X13296)相比较分析。结果PCR扩增产物大小与预期结果一致;测序分析表明,成功扩增到白色假丝酵母菌CYP51基因,与X13296序列相比较,两个耐药株都存在有义突变和无义突变,两株白色假丝酵母菌共有22个碱基突变;突变发生氨基酸替换的有F105L、K128T、Y132H、T199I、R267H、G464S和G467K,其中,两株菌都有Y132H和G467K突变,F71L、W244R、T311N和T352I为新发现的突变,同时,也发现了9个未发生氨基酸替换的突变。结论白色假丝酵母菌对唑类抗真菌药物的耐药与CYP51基因突变有关,且为多位点突变,研究发现了新的突变点,它在耐药机制中的作用需进一步研究。

禾谷镰刀菌CYP51A基因对五种三唑类杀菌剂敏感性的影响

为进一步明确14α-脱甲基酶编码基因CYP51A在禾谷镰刀菌Fusarium graminearum对三唑类杀菌剂敏感性中的作用,利用Split-marker方法敲除禾谷镰刀菌CYP51A基因并获得敲除CYP51A基因的禾谷镰刀菌ΔFgCYP51A菌株,比较该菌株和野生型菌株PH-1对5种三唑类杀菌剂的敏感性变化。结果表明,ΔFgCYP51A菌株对丙环唑、戊唑醇、烯唑醇、三唑醇和三唑酮的EC_(50)分别为0.024、0.047、0.148、0.154和0.474 mg/L。ΔFgCYP51A菌株对戊唑醇、三唑醇、三唑酮和丙环唑的敏感性均显著增加,而对烯唑醇的敏感性无明显变化。表明FgCYP51A基因与禾谷镰刀菌对三唑类杀菌剂的敏感性有关。

小麦赤霉病菌对叶菌唑的抗性风险分析

采用菌丝生长速率法,测定了2012‒2014年采自我国江苏、安徽、山东和河南4个省份的100株小麦赤霉病菌对叶菌唑的敏感性,并通过室内药剂驯化获得叶菌唑抗性突变体,研究了抗性突变体的适合度及CYP51基因序列和表达量。结果表明:叶菌唑对供试菌株的EC50值范围为0.04~0.51μg/mL,平均EC50值为(0.18±0.09)μg/mL,供试菌株对叶菌唑的敏感性频率分布呈近似正态的连续性单峰曲线,尚未出现抗药性亚群体,可将该平均EC50值作为敏感性基线的参考值,用于监测田间抗药性的演化。通过室内药剂驯化共获得12株抗性突变体,其中2株表现为中等水平抗性,抗性倍数(RI)分别为14.2和15.8,10株表现为低水平抗性,RI值为3.25~9.05。与亲本菌株相比,部分抗性突变体的菌丝生长速率及分生孢子产生能力均显著降低,所有抗性突变体对小麦的致病力均显著降低。交互抗性研究表明,部分抗性突变体对戊唑醇、丙环唑及咪鲜胺表现为抗性,对丙硫菌唑和三唑酮未表现出抗性;部分抗性突变体仅对戊唑醇表现为抗性,对丙环唑、咪鲜胺、丙硫菌唑和三唑酮均未表现出抗性;所有抗性突变体对氰烯菌酯均表现为敏感。研究表明,小麦赤霉病菌对叶菌唑存在低等抗性风险。与亲本菌株相比,2株中等水平和2株低水平抗性突变体的CYP51基因及启动子序列均未发生突变;4株抗性突变体的CYP51A基因表达量均上调,上调倍数范围为1.33~10.28,推测CYP51A基因表达量上调可能与小麦赤霉病菌对叶菌唑抗性的产生相关。

耐伊曲康唑烟曲霉菌对泊沙康唑的敏感性分析

目的测定耐伊曲康唑烟曲霉菌对泊沙康唑的敏感性,探讨cyp51A基因突变对其敏感性的影响,提高对耐伊曲康唑烟曲霉菌的认识。方法选择2012年2月-2013年12月3株耐伊曲康唑烟曲霉菌,参照欧洲抗菌药物敏感试验委员会(EUCAST)E.DEF 9.2方法,测定其对泊沙康唑的最低抑菌浓度(MIC),进行烟曲霉菌cyp51A基因提取、扩增、测序,将所得序列同GenBank中烟曲霉菌标准株AF.338659的cyp51A序列进行比对,查看有无突变序列。结果 3株耐伊曲康唑烟曲霉菌对泊沙康唑的MIC分别为0.03、0.06、0.03mg/L,均判定为对泊沙康唑敏感;其均存在cyp51A基因突变,突变位点分别为M220I、TR/L98H和TR/L98H。结论泊沙康唑对耐伊曲康唑烟曲霉菌在体外表现为较好的敏感性,且其敏感性与烟曲霉菌cyp51A基因突变无明显相关。

烟曲霉菌对唑类抗真菌药的耐药机制研究进展

唑类抗真菌药是曲霉病处理中一种最为常用的药物,而曲霉病主要是由烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)感染引起的。越来越多的报道发现A.曲霉株(A.fumigatus isolates)具有唑类抗真菌药耐药性,这是曲霉病治疗中一个巨大的挑战。A.曲霉唑类抗真菌药耐药株(ARAF)在侵袭性曲霉病患者中具有非常高的致死率,这对临床微生物学者如何及时诊断耐药性和提出合适的干预策略等方面提出极大的挑战。ARAF耐药株既存在cyp51A突变型又存在cyp51A非突变型,而且cyp51A非突变型在唑类抗真菌药耐药中占有的比重越来越高,为临床的诊断和治疗提出了更高的挑战。本综述总结了目前A.曲霉唑类抗真菌药耐药株在全球各国的发病情况及其耐药机制研究的最新进展。