中药粉膜Ⅱ号体外抗HSV-2作用的实验研究

目的:研究中药粉膜Ⅱ号抗 HSV-2作用机理。方法:利用体外细胞培养技术,采用微量细胞病变抑制法来研究中药各浓度组的抑制病毒增殖作用、直接杀伤病毒作用及预防病毒感染细胞作用,本实验以病毒滴度和抑病毒指数为指标。结果:(1)抑制病毒增殖实验:中药粉膜Ⅱ号1.63、0.81、0.41mg/ml 浓度组的病毒滴度与病毒对照组比较,差异有显著性(P<0.01),抑病毒指数>2;(2)直接杀伤病毒实验:中药粉膜Ⅱ号1.63mg/ml—8h 组、1.63mg/ml—24h 组、0.81mg/ml—24h 组的病毒滴度与病毒对照组比较,差异有显著性(P<0.05),其余各组的病毒滴度与病毒对照组比较,差异无显著性(P>0.05);(3)预防作用实验:中药各浓度组的病毒滴度与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:中药粉膜Ⅱ号具有抗 HSV-2病毒的作用,而无预防病毒感染细胞作用。

单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的基因扩增、克隆及其B细胞抗原表位分析

目的:克隆单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G-2(gG-2)全长基因并对糖蛋白G-2进行B细胞抗原表位预测.方法:用PCR法扩增HSV-2的gG-2基因,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α株后测序.利用Lasergene,C lustal X等软件,进行B细胞抗原表位预测.结果:完成单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆.通过B细胞抗原表位分析,发现HSV-1的gG-1和HSV-2的gG-2氨基端的同源性很低.gG-2蛋白在“独特区”存在抗原指数非常强的抗原表位.结论:成功构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)gG-2全长基因克隆,为单纯疱疹病毒感染的诊断试剂的研发及抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供研究材料和参考.

单纯疱疹病毒Ⅱ型经不同途径感染BALB/c小鼠的病理学研究

目的观察并比较分析单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)经不同途径感染小鼠后的致病情况。方法将6周龄雌性BALB/c小鼠分为实验组和对照组。实验组小鼠分别经滴鼻、生殖道途径感染HSV-2(每只104CCID50/20 μl),对照组小鼠经上述两种途径注射PBS。感染后不同时间点,分别取肺、神经系统、生殖系统组织进行病理学观察及病毒载量检测。通过原位杂交对小鼠三叉和骶神经节中lat基因的表达进行定位,同时对组织中病毒进行重激活检测。结果两种途径感染HSV-2的小鼠体重在6 d后均呈下降趋势,且均能观察到组织病理损伤。鼻腔感染以肺泡壁充血、脑血管袖套、淋巴细胞浸润等肺部、中枢神经系统病理损伤为主;而生殖道感染组主要出现是骶神经节坏死、阴道和子宫嗜酸性粒细胞增多、卵巢充血等生殖道病理现象。经两种途径感染的小鼠组织器官中病毒载量的情况也印证了上述病理结果,即鼻腔感染组小鼠的神经、肺组织中病毒载量明显高于生殖道组,而生殖道感染组小鼠的生殖道和骶神经节中病毒增殖则明显高于鼻腔感染组。感染后28 d,在处于潜伏感染小鼠的三叉和骶神经节中均能检测到HSV-2 lat基因mRNA的阳性信号,并且采集的组织碎块均能在与Vero细胞共培养时使细胞病变,且生殖道感染组的lat基因阳性信号及重激活后病毒增殖趋势相对高于鼻腔感染组。结论HSV-2通过鼻腔和生殖道两种途径感染BALB/c小鼠均能引起组织病理损伤,且病理损伤空间特异性与感染途径密切相关。

UL29shRNA表达质粒与ACV对HSV-2抑制效果的比较

目的:通过将筛选的UL29shRNA表达质粒与抗病毒药物阿昔洛韦(ACV)的抗病毒效果及细胞毒性进行比较,探讨RNA干扰在细胞水平上对HSV-2病毒的抑制效果。方法:将筛选的干扰效果最好的表达质粒UL29-shRNA1641作为RNA干扰组与抗病毒药ACV进行对HSV-2的抑制效果的比较研究,分为RNAi组、ACV组和RNAi+ACV组。采用实时荧光定量PCR检测UL29mRNA的相对表达量,Karber法检测细胞上清液中病毒滴度的变化、蛋白印迹法(Western blot)检测ICP8的相对表达量,对RNAi与ACV抑制效果进行比较,通过WST-1(Water-Soluble Tetrazolium-1)法对质粒转染复合物(质粒+转染试剂)和ACV的细胞毒性进行比较。结果:RT-PCR检测三组mRNA的相对表达水平,其中RNAi组UL29基因相对表达量高于ACV组(P<0.05);RNAi+ACV组UL29基因相对表达量明显低于RNAi组和ACV组(P<0.05)。Karber法检测三组细胞上清液病毒滴度表明,RNAi组病毒滴度高于ACV组(P<0.05),RNAi+ACV组的病变病毒滴度明显低于RNAi组和ACV组(P<0.05)。Western blot检测ICP8相对表达量,ACV组的ICP8(UL29编码的单链DNA结合蛋白,主要作用是在HSV-2 DNA复制过程中与复制叉产生了单链DNA结合,防止其重新配对形成ds DNA或被核酸酶降解)相对表达量比RNAi组低(P<0.05)。RNAi+ACV组ICP8相对表达量降低最为明显,与ACV组和RNAi组相比有显著差异(P<0.05)。WST-1法对转染复合物与ACV的细胞毒性进行比较,其中RNAi中质粒和转染试剂对细胞的毒性明显小于ACV。结论:在RNAi与ACV对HSV-2抑制效果的比较中,ACV要好于RNAi,两者联合使用的抑制效果好于单独使用RNAi或ACV。在抑制效果都较好的情况下比较,RNAi中使用的质粒与转染试剂对细胞的影响比ACV小。

白介素18和干扰素γ在生殖器疱疹感染中的意义

目的探讨白介素18(IL-18)和干扰素γ(IFN-γ)在单纯疱疹病毒2型(HSV-2)感染的生殖器疱疹患者发病机制中的意义。方法采用双夹心ELISA方法对43例确诊为HSV-2感染的生殖器疱疹患者外周血单一核细胞(PBMC)及血清IL-18和IFN-γ进行检测,设立健康对照组。结果HSV-2感染的生殖器疱疹患者的血清及PBMC中IL-18水平分别为(424.32±51.60)ng/L和(417.54±47.23)ng/L,均明显高于对照组,差异有显著性(P<0.01);HSV-2感染者血清IFN-γ水平为(384.84±72.45)ng/L,明显高于对照组,两组差异有显著性(P<0.01);PBMCIFN-γ水平(381.62±70.45)ng/L,亦明显高于对照组,差异有显著性(P<0.01);HSV-2感染生殖器疱疹患者血清IL-18和IFN-γ呈正相关(r=0.515,P<0.05);rhIL-18可诱导PBMC产生IFN-γ。结论HSV-2感染的生殖器疱疹患者体内IL-18水平升高,并与IFN-γ呈正相关,rhIL-18可刺激HSV-2感染者PBMC产生IFN-γ,IL-18具有明显的抗HSV-2感染作用,其机制可能与诱导IFN-γ产生有关。