RyhB-cysE基因对禽致病性大肠杆菌生物表型的影响

在禽致病性大肠杆菌(APEC)AE17及AE17△RyhB的基础上利用Red同源重组技术构建基因缺失株AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE,对野生株和基因缺失株的生长、生物被膜形成和运动特性进行分析,并采用qRT-PCR技术比较野生株和缺失株中与运动性、生物被膜形成相关基因的转录水平。结果显示,各菌株生长曲线无显著差异;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE生物被膜形成能力较AE17显著下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE运动能力与AE17相比下降;AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比flhB、flgD、fliF和cheY转录水平均降低,而AE17△RyhB△cysE与AE17△cysE相比基因转录水平均有所增强;AE17△RyhB、AE17△cysE、AE17△RyhB△cysE与AE17相比,flhD、flgC、sidA转录水平均显著降低。表明cysE基因缺失降低了APEC生物被膜形成能力及运动能力,且RyhB基因缺失对cysE基因的运动能力调控作用有代偿作用,RyhB、cysE基因均通过调节与生物被膜形成相关的基因(flhD、flgC、sidA)转录水平调控APEC生物被膜形成能力,本研究结果为研究RyhB-cysE基因对APEC的调控作用奠定了基础。

大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆大肠杆菌半胱氨酸合成酶(包括丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysM))的基因,对其进行原核表达,并制备相应蛋白的抗体。【方法】用PCR方法从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增cysE和cysM基因,构建其原核表达载体pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM,对其进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot(以His抗体作为一抗)检测。用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。【结果】PCR获得了822bp的cysE基因和912bp的cysM基因。原核表达质粒pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM构建成功,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的cysE和cysM重组蛋白分子质量分别为56和58ku。制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度均达到1∶102 400。【结论】成功克隆了大肠杆菌cysE和cysM基因,并实现了原核表达,同时制备出了相应的多克隆抗体。

艰难梭菌CysE和CysK蛋白的克隆、表达与生物信息学分析

目的生物信息学分析艰难梭菌半胱氨酸合成蛋白CysE和CysK的理化性质、三维结构和蛋白互作信息,并进行两个蛋白的体外克隆表达和纯化。方法采用ProtParam对CysE和CysK蛋白进行理化性质预测,TMHMM进行跨膜结构域分析,SignalP分析蛋白信号肽,SWISS-MODEL预测二者的三维结构,STRING分析蛋白互作信息。将cysE和cysK目的基因片段分别克隆到pET-32a和pET-28a载体,融合His标签通过大肠埃希菌表达系统来表达目的蛋白,并进行表达纯化测试。结果CysE蛋白共有196氨基酸(AA),无跨膜区,信号肽序列为无,疏水性一般,有2个无序性片段。CysK蛋白共有302 AA,无跨膜区,信号肽序列为无,疏水性一般,有5个无序性片段。两个蛋白共产生α螺旋、β片层、β转角和无规卷曲4种二级结构。CysE的二级结构共由5个α螺旋、15个β片层、10个β转角和19个无规卷曲组成;CysK的二级结构共由15个α螺旋、16个β片层、16个β转角和26个无规卷曲组成。蛋白互作预测结果显示,CysE与CysK涉及菌株的蛋白合成和代谢途径,主要是半胱氨酸的合成途径、甲硫氨酸的合成以及硫代谢途径等。重组表达载体pET-32a-cysE和pET-28a-cysK构建成功,对蛋白诱导表达条件进行优化后,进行SDS-PAGE电泳。结果显示,两个蛋白的分子量分别为CysE 38 ku和CysK 34 ku,二者的纯度大于85%。最终得到的CysE重组蛋白浓度为0.8 mg/mL,CysK重组蛋白的浓度为1 mg/mL。结论本研究对艰难梭菌CysE和CysK的蛋白进行了生物信息学分析,并成功构建和表达了CysE与CysK重组蛋白,为进一步探索二者对于艰难梭菌致病性的相关机制提供了基础。

102例牙源性颌骨囊肿的X线影像分析

目的:分析颌骨囊肿X线影像,提高对颌骨囊肿X线表现的认识。方法:回顾分析102例经病理证实的颌骨囊肿和肿瘤的影像资料。结果:X线检查简便易行,且能确诊大多数颌骨囊肿。结论:常规的X线检查可以诊断大部分患者,对于不典型X线表现的患者需结合CT、穿刺和活检进一步确定诊断,制定治疗方法。